Hypochondriaca: regio hypochondriaca sinistra — перевод на русский язык

Скорость потребления кислорода (V˙O ₂ ) измеряли на стадиях 16, 18, 20 и 22 эмбриона по Госнеру (вылупление) у независимых эмбрионов при температуре, при которой эмбрионы инкубировались ( n = 8 на стадию для каждой стадии). лечение). V˙O ₂ определяли по снижению парциального давления кислорода (PO ₂ ) в закрытой респирометрической системе. Отдельные эмбрионы / вылупившиеся птенцы были помещены в дыхательные камеры (объем: 0.94–1,17 мл), содержащий сенсорное пятно размером 5 мм O ₂ (Loligo System, Тьеле, Дания). Четыре камеры помещали в рециркуляционную водяную баню, термостатированную до заданной температуры с помощью рециркуляционного нагревателя / холодильника (Thermo Fisher Scientific, IsotempTM 6200, Уолтем, Массачусетс, США). Пятно датчика в каждой камере считывалось оптоволоконным кабелем (PreSens Precision Sensing, GmbH, Регенсбери, Германия), подключенным к измерителю кислорода Witrox 4 (Loligo Systems, Тьеле, Дания) с компьютером, на котором установлено программное обеспечение Autoresp ^TM (Loligo Systems, Тьеле, Дания).Уровни кислорода в каждой камере измеряли каждые 5 минут в течение примерно 120 минут. Первые ∼40 мин были исключены из расчета V˙O ₂ , чтобы учесть манипуляции и позволить эмбрионам достичь устойчивого состояния потребления кислорода. Самый низкий зарегистрированный уровень кислорода в камерах составлял 12 кПа, и V˙O ₂ всегда был стабильным (линейным) в течение 120-минутного периода измерения, что указывает на то, что уровни O ₂ были выше тех, которые могут отрицательно повлиять на V˙O ₂ . V˙O ₂ (мкл ч ^-1 ) рассчитывали с использованием следующего уравнения:

V˙O2 = (PO2 (t2) −PO2 (t1) t2 − t1) * β * V

, где PO _{2 (t2)} –PO _{2 (t1)} — уменьшение PO ₂ (кПа) в камере за период времени ( t ₂ –t ₁ , h), β — емкость воды при соответствующей температуре (мкл O ₂ мкл ^-1 кПа ^-1 ), а V — объем камеры за вычетом объема зародыша (мкл, рассчитанный по массе ).Каждая камера была откалибрована свежим бескислородным раствором 10 мг сульфита натрия в 1 мл воды (0%) и уравновешенной воздухом воды (100%). Все значения V˙O ₂ были скорректированы на V˙O ₂ пустой камеры с учетом любого потребления кислорода микробами. Масс-специфический V˙O ₂ (мкл · ч ^-1 мг ^-1 ) рассчитывали путем деления V˙O ₂ на массу без желтка.

Масса эмбриона

Лица, использованные для определения V˙O ₂ , и другие эмбрионы, отобранные на эмбриональных стадиях 16, 18, 20 и 22 (вылупление), были помещены в 4% параформальдегид (PFA) в фосфатно-солевом буфере (PBS; pH = 7.4) в микроцентрифужных пробирках. После фиксации в 4% PFA в течение 36 ± 1 дня эмбрионы / вылупившиеся птенцы были удалены из их хориона (если это еще не сделано) и сфотографированы под препарирующим микроскопом (10-15X, Zoom Stereo Trinocular Microscope, Amscope, Irvine, CA, United States ) с цифровой камерой USB 3.0 (Amscope, Ирвин, Калифорния, США). Затем желток осторожно отделяли от эмбриона, и эмбрион и желток взвешивали до ± 0,01 мг (XA105DU, Mettler-Toledo, Columbus, OH, США). Эмбрион и желток сушили при 65 ° C в течение 24 ч (печь модели 10, Quincy Lab, Inc., Чикаго, Иллинойс, США) и повторно взвесили. Стадия каждого эмбриона подтверждена фотографиями.

Инкубация личинок

Подмножеству эмбрионов давали вылупиться и поддерживали при каждой температурной обработке эмбриона до 5-7 дней после первого кормления. Затем личинок при каждой температуре случайным образом разделяли на две группы и акклиматизировали до 20 или 25 ° C. Температура личинок повышалась на 1–2,5 ° С. ^–1 сутки. В результате было создано 8 температурных обработок личинок (рис. 1).Личинок содержали при каждой температуре в стареющей водопроводной воде в прямоугольных пластиковых контейнерах объемом 2 л при плотности 5–8 личинок L ^-1 и в режиме свет: темнота 12 ч: 12 ч. Дважды в неделю контейнеры очищали от отходов, 30% воды заменяли свежей выдержанной водой, а личинок кормили вареным салатом ad libitum .

Норма повседневного потребления кислорода личинкой и критический температурный максимум

За развитием личинок наблюдали до стадий 32–36 по Госнеру (1960), которые представляют дифференцировку задних конечностей пальцев стопы.Личинки акклиматизировались к температуре 20 или 25 ° C минимум за 2 недели до достижения этих стадий. Средний период акклиматизации для каждой температурной обработки перед экспериментом был следующим: 10–20 ° C: 52 ± 3 дня, 15–20 ° C: 46 ± 2 дня, 20–20 ° C: 40 ± 3 дня, 25– 20 ° C: 31 ± 2 дня, 10-25 ° C: 53 ± 1 день, 15-25 ° C: 34 ± 3 дня, 20-25 ° C: 27 ± 2 дня и 25-25 ° C: 32 ± 3 дн.

После того, как личинка достигла репрезентативной стадии, стандартный V˙O ₂ был измерен при температуре акклиматизации с использованием периодической респирометрии ( n = 6–16 на обработку).Индивидуальных личинок помещали в респирометрические камеры объемом ~ 8,2 мл, содержащие сенсорное пятно размером 5 мм O ₂ (Loligo System, Tjele, Дания), и считывали, как описано выше для эмбрионального V˙O ₂ . Прерывистый цикл с периодами промывки 60 с, периода ожидания 240 с и измерения 300 с контролировали с помощью программного обеспечения Daq-M и Autoresp ^TM (Loligo Systems, Tjele, Дания). В результате этого прерывистого цикла PO ₂ камер никогда не опускался ниже 17 кПа. Испытания проводились как минимум в течение 120 минут, и первые ~ 40 минут были исключены из расчета V˙O ₂ , чтобы учесть манипуляции и позволить личинкам достичь устойчивого состояния потребления кислорода.Каждая камера была откалибрована свежим бескислородным раствором 10 мг сульфита натрия в 1 мл воды (0%) и уравновешенной воздухом воды (100%). Во время испытаний невозможно было полностью удерживать личинок в неподвижном состоянии, поэтому измерения отражают обычную скорость метаболизма (т. Е. V29O ₂ , что представляет собой потребление O ₂ при относительно низких уровнях активности). Все значения V˙O ₂ были скорректированы на V˙O ₂ пустых камер, чтобы учесть любое потребление кислорода микробами.После определения V˙O ₂ личинок умерщвляли в MS-222, ставили, взвешивали и фиксировали в 4% PFA в PBS. После фиксации в течение ~ 30 дней кишечник отделяли от личинок и определяли влажные и сухие массы, как описано выше для эмбрионов.

Критический тепловой максимум (CTMax) был определен для отдельной подгруппы личинок ( n = 5–14 на обработку) на тех же стадиях развития, что и измерение V˙O ₂ . Для каждого испытания CTMax отдельные личинки помещали в трехугольные пластиковые химические стаканы объемом 250 мл (Globe Scientific, Inc., Парамус, штат Нью-Джерси, США), наполненный выдержанной водопроводной водой соответствующей температуры. Стаканы были подвешены в рамке из полистирола в пластиковой водяной бане с полистирольной изоляцией объемом 20 л, которую непрерывно нагревали во время испытания двумя аквариумными нагревателями мощностью 150 Вт (EHEIM GmbH), а вода в ванне циркулировала с помощью аквариумного насоса (15 л мин. ^-1 , Lifeguard Aquatics, Серритос, Калифорния, США). Во всех отдельных испытательных камерах была предусмотрена умеренная аэрация для предотвращения термического расслоения.Температуру воды в стакане измеряли с помощью водонепроницаемого термометра VWR ^® Traceable ^® Ultra (± 0,1 ° C) (VWR, Radnor, PA, США). Температуры повышались на 0,33 ± 0,01 ° C мин. ^-1 . Повышение температуры продолжалось до тех пор, пока личинки не демонстрировали потерю равновесия (LOE), определяемую как неспособность реагировать на механическую стимуляцию и дорсо-вентральную ориентацию, и, таким образом, неспособность показать реакцию бегства (Cupp, 1980; Sherman and Levitis, 2003). Когда головастики достигли LOE, температура в химическом стакане регистрировалась, и температура корректировалась на основе откалиброванного цифрового термометра VWR ^® Traceable ^® (точность ± 0.0001 ° С; точность ± 0,05 ° C; Avantor, VWR, Radnor, PA, США). После LOE личинок немедленно удаляли из камеры CTMax и возвращали к температуре их акклиматизации. Личинкам давали возможность восстановиться в течение ≥1 часа, после чего их умерщвляли в MS-222, сушили и взвешивали до 0,01 мг. 90% личинок выживали в течение ≥1 часа после испытаний, и только значения CTMax для выживших были включены в анализ.

Статистический анализ

Данные были проверены на нормальность и однородность дисперсий с использованием теста Шапиро-Уилка и О’Брайена, соответственно, и использовались соответствующие параметрические или непараметрические тесты.Использовался непараметрический анализ, поскольку отсутствие преобразований гарантировало соответствие непараметрических данных параметрическим допущениям. Время до 50% вылупления, продолжительность вылупления, выживаемость при 50% вылуплении сравнивали по температуре инкубации эмбрионов с использованием теста Краскела-Уоллиса с post hoc сравнениями Steel-Dwass. Влажную массу, сухую массу и содержание воды в эмбрионах и желтке на разных стадиях развития и температуре исследовали с помощью непараметрического двухфакторного дисперсионного анализа Фридмана со стадией развития, температурой и взаимодействием между стадией развития и температурой в качестве эффектов.Массово-специфический VO ₂ на разных стадиях развития и температуре исследовали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа со стадией развития, температурой и взаимодействием между стадией развития и температурой в качестве эффектов. Post hoc сравнения Tukey HSD использовали, когда эффекты были значительными.

Личиночный масс-специфический V˙O ₂ сравнивали при различных температурах с использованием двухфакторного дисперсионного анализа с температурой эмбриона, температурой акклиматизации личинок и взаимодействием между температурами эмбриона и личинки в качестве эффектов.Сравнение Tukey HSD использовалось, когда эффекты были значительными. CTMax личинок сравнивали при различных температурах с использованием двустороннего анализа ANCOVA с температурой эмбриона и температурой акклиматизации личинок в качестве основных эффектов и сухой массой в качестве коварианты. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего, и различия были приняты как статистически значимые при α = 0,05.

Результаты

Эмбриональное развитие, рост и потребление кислорода

Все эмбрионы вылупились на стадии 22 по Госнеру (1960).Выживаемость (%) была высокой на протяжении всего эмбрионального развития и не зависела от температуры, с 92–97% выживаемостью при 50% вылуплении при всех температурах (χ ² ₃ = 3,8, P = 0,28, рис. 2A). При повышении температуры время до 50% вывода значительно сократилось с 21 дня после оплодотворения (dpf) при 10 ° C до 5 dpf при 25 ° C (χ ² ₃ = 34,2, P <0,0001, Рисунок 2B ). Q ₁₀ для скорости развития составляла 2,8 для 10–15 ° C, 3,1 для 15–20 ° C и 2.0 для 20–25 ° C, с общим Q ₁₀ , равным 2,5 для 10–25 ° C. Продолжительность вылупления (d) также значительно снизилась с повышением температуры инкубации, но существенно не различалась между 20 и 25 ° C (χ ² ₃ = 27,5, P <0,0001, Рисунок 2C).

Рисунок 2. (A) Выживаемость при выводе (%), (B) время до 50% вывода (дни после оплодотворения, dpf) и (C) окно вывода (дни с первого по последний вывод) вылупившихся птенцов, инкубированных при разных температурах.Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего, n для каждой температуры следующим образом: 10 ° C = 6, 15 ° C = 13, 20 ° C = 10, 25 ° C = 9. Различные буквы указывают на существенные различия между температурами на основе Краскела-Уоллиса. test и сравнения Steel-Dwass post hoc .

Влажная масса эмбриона увеличивалась со стадией развития ( F _3,387 = 87,7, P <0,0001) и находилась под влиянием взаимодействия стадии и температуры ( F _9,387 = 5.5, P <0,0001), но не температуры ( F _3,387 = 1,4, P = 0,26) (рисунок 3A). Влажная масса эмбриона была одинаковой при разных температурах на стадии 16, 18 и 20. На стадии 22 (вылупление) влажная масса эмбриона была выше при 25 ° C по сравнению с другими температурами, а влажная масса эмбриона при 15 ° C была выше, чем при 20 °. С. Сухая масса зародыша при вылуплении для всех температур вместе взятых была значительно выше по сравнению с более ранними стадиями ( F ₃₃₈₀ = 2,7, P = 0.04), но на него не влияла температура ( F _3,380 = 1,4, P = 0,24) или взаимодействие стадии и температуры ( F _9,380 = 1,7, P = 0,08) ( Рисунок 3B). Большая часть увеличения сырой массы во время разработки была связана с увеличением содержания воды, которое увеличивалось со стадией ( F _3,380 = 113,8, P <0,0001), а также значительно зависело от температуры ( F _3,380 = 14.9, P <0,0001) и взаимодействие стадии и температуры ( F ₉₃₈₀ = 6,8, P <0,0001) (Рисунок 3C). Значительное взаимодействие произошло из-за более низкого содержания воды в эмбрионе на стадии 18 для эмбрионов 25 ° C по сравнению с другими температурами и более низкого содержания воды на стадии 20 для эмбрионов 10 и 15 ° C. По 22 этапу отличий не было.

Рисунок 3. (A) Влажная масса зародыша (мг), (B) сухая масса зародыша (мг), (C) содержание воды в эмбрионе (%), (D) влажная масса желтка (мг), (E) сухой массы желтка (мг) и (F) содержания воды в желтке (%) на протяжении всего эмбрионального развития при различных температурах инкубации.Стадии развития по Госнеру (1960). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего, n = 5–11 для этапа 16, 7–20 для этапа 18, 8–16 для этапа 20, 39–121 для этапа 22. Буквы на A , C, и E указывают на значительные различия, основанные на взаимодействии между стадией развития и температурой (двухфакторный дисперсионный анализ, сравнение Tukey post hoc с ). Буквы B , D, и F указывают на значительные различия между стадиями для всех температур вместе взятых (двухфакторный дисперсионный анализ, сравнение Tukey post hoc ).

Влажная масса желтка уменьшалась со стадией ( F _3,384 = 20,2, P <0,0001) и зависела от температуры ( F _3,384 = 4,7, P <0,01), но не взаимодействия ступени и температуры ( F _9,384 = 1,8, P = 0,07) (Рисунок 3D). Для всех стадий общая влажная масса желтка была выше при 10 ° C по сравнению с другими температурами. Сухая масса желтка уменьшалась со стадией ( F _3,379 = 46.1, P <0,0001) и зависел от температуры ( F _3,379 = 4,0, P <0,01) и взаимодействия стадии и температуры ( F _3,379 = 3,3, P <0,001) (рисунок 3E). Значительное взаимодействие было связано с более высокой сухой массой желтка при вылуплении для эмбрионов 10 ° C по сравнению с 15 и 25 ° C. Содержание воды в желтке было самым низким на стадии 20 по сравнению с стадиями 16 и 22 для всех температур вместе взятых ( F _3,379 = 5.0, P <0,01), но на него не влияла температура ( F _3,379 = 2,7, P = 0,09) или взаимодействие ступени и температуры ( F _9,379 = 1,5, P = 0,14) (Рисунок 3F).

Эмбриональный масс-специфический V˙O ₂ находился под влиянием стадии ( F ₃₁₃₀ = 38,7, P <0,0001) и температуры ( F ₃₁₃₀ = 35,5, P <0,0001) и взаимодействие стадии и температуры ( F _{9,130 ​​} = 4.4, P <0,0001) (рисунок 4). Взаимодействие произошло из-за того, что масс-специфический V˙O ₂ существенно не изменился на разных стадиях для эмбрионов, инкубированных при 10 и 15 ° C, но действительно увеличивался в процессе развития при 20 и 25 ° C. Массово-специфический V˙O ₂ не зависел от температуры на стадии 16. Однако по мере развития масс-специфический V˙O ₂ расходился, и он значительно отличался для эмбрионов 10 и 15 ° C по сравнению с 20 и 25 ° C на ступенях 18 и 20.При выводе (стадия 22) удельный вес V˙O ₂ увеличивался с увеличением температуры, за исключением статистически аналогичных значений при 10 и 15 ° C. Q ₁₀ значения для массового VO ₂ при вылуплении составляли 1,2 для 10–15 ° C, 3,8 для 15–20 ° C и 2,0 для 20–25 ° C, с общим Q ₁₀ из 2.1 для 10–25 ° C.

Рис. 4. Массовый расход кислорода (V˙O ₂ , мкл ч ^-1 мг ^-1 ) эмбрионов, инкубированных при различных температурах.Стадии развития по Госнеру (1960). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего, n = 8 для всех точек данных. Буквы указывают на существенные различия, основанные на взаимодействии между стадией развития и температурой (двухфакторный дисперсионный анализ, сравнение Tukey post hoc ).

Скорость потребления кислорода личинками и критический температурный максимум

Личиночный масс-специфический V˙O ₂ находился под влиянием температуры эмбриона ( F _3,75 = 2,5, P = 0.035), температура акклиматизации личинок ( F _1,75 = 7,9, P <0,01) и взаимодействие между эмбриональной и личиночной температурами ( F _3,75 = 2,8, P = 0,044 ) (Рисунок 5A). Температура зародыша влияла на масс-удельный V˙O ₂ только при температуре акклиматизации личинок 25 ° C. После акклиматизации к 25 ° C личинки, инкубированные при 20 ° C в качестве эмбрионов, продемонстрировали более высокий масс-специфический V˙O ₂ , чем личинки, инкубированные при 10 ° C в качестве эмбрионов.

Рисунок 5. (A) Удельный расход кислорода (V˙O ₂ , мкл ч ^-1 мг ^-1 ) и (B) критический тепловой максимум (° C) личинок акклиматизировались либо к 20, либо к 25 ° C после инкубации эмбриона при различных температурах. Личинки измерены на стадии 32–36 по Госнеру (1960) (дифференциация пальцев стопы задних конечностей). Данные представлены в виде среднего значения ± SEM, n = 6–16 для V˙O ₂ , n = 5–14 для CTMax.Разные буквы указывают на существенные различия между всеми видами лечения, связанными с инкубацией эмбрионов и акклиматизацией личинок (двухфакторный дисперсионный анализ, сравнение Tukey post hoc ).

На критический тепловой максимум существенно влияла температура эмбриона ( F _3,58 = 7,0, P <0,001), температура акклиматизации личинок ( F _1,58 = 44,0, P <0,0001) , взаимодействие между эмбриональной и личиночной температурами ( F _3,58 = 3.5, P = 0,028), но не сухой массы ( F _1,58 = 2,9, P = 0,1). Среднее значение CTMax было на 1,8 ° C выше при температуре акклиматизации 25 ° C по сравнению с 20 ° C (рис. 5В). Однако в некоторых случаях температура эмбриона оказывала стойкое воздействие. При температуре акклиматизации головастиков 20 ° C личинки инкубировали при 20 ° C, поскольку у эмбрионов CTMax было ниже, чем у личинок, инкубированных при 25 ° C. Напротив, CTMax был одинаковым для всех температурных обработок эмбрионов при акклиматизации 25 ° C.

Обсуждение

Одним из наиболее динамичных источников физиологической фенотипической пластичности является температура окружающей среды на ранних этапах развития, и прогнозирование устойчивых физиологических последствий для организмов различных таксонов является областью значительного текущего исследовательского интереса (Kim et al., 2017; Noble et al., 2018; Ruthsatz et al., 2018; Warner et al., 2018). Мы исследовали эту центральную идею в сравнительной физиологии на примере P. hypochondriaca , земноводного, который на протяжении своей жизни испытывает широкий диапазон температур.Мы продемонстрировали, что температура во время эмбрионального развития имела как непосредственные эмбриональные эффекты, так и эффекты переноса личинок, которые влияли на физиологические функции. Повышенная температура во время эмбрионального развития не снижает выживаемость или массу, несмотря на повышенную потребность в энергии, которая поддерживает более быстрое развитие. Акклимация к более высокой температуре во время развития личинок обычно вызвала повышенную термостойкость, тогда как аэробный метаболизм не показал никаких изменений или умеренное увеличение при более высокой температуре акклиматизации личинок.Температура инкубации эмбрионов имела определенные стойкие эффекты. А именно, температура эмбриона 10 ° C приводила к снижению V˙O ₂ при температуре акклиматизации личинок 25 ° C, а эмбриональное развитие при 25 ° C приводило к высокой термостойкости акклиматизированных личинок 20 ° C. Следовательно, у термостойких видов, таких как P. hypochondriaca , среда развития оказывает долгосрочное влияние на фенотип. Это особенно важно в отношении температуры, поскольку может дать ценную информацию о реакции видов на изменение климата.

Непосредственное влияние температуры во время эмбрионального развития

Эмбриональные реакции на температуру у P. hypochondriaca продемонстрировали широкую термостойкость этого вида. Развитие до вылупления было очень успешным во всем исследованном диапазоне температур (10-25 ° C) (рис. 2A), что соответствует предыдущим исследованиям, которые указывают на успешное эмбриональное развитие при температурах до 29 ° C (Brown, 1975). Однако несколько удивительно, что выживаемость оставалась такой высокой (97%) при 25 ° C.Эта температура редко регистрировалась в том месте, где были собраны яйца (Мюллер, неопубликованные данные), однако эмбрионы не проявляют видимых побочных эффектов. Хотя выживаемость была постоянной при разных обработках, температура действительно приводила к постепенному увеличению скорости эмбрионального развития, что отражалось в сокращении времени вылупления до 50% (Рисунок 2B) и уменьшении окна вывода (Рисунок 2C). Повышенная скорость развития с температурой была ожидаемым результатом и наблюдалась у многих земноводных (McLaren, Cooley, 1972; Kuramoto, 1975; Bradford, 1990; Seymour et al., 1991; Митчелл и Сеймур, 2000). Q ₁₀ для скорости развития составлял 2,5 во всем исследованном диапазоне температур, что находится в нижнем диапазоне значений Q ₁₀ (2,0–4,5), измеренных у других амфибий в том же диапазоне температур (Kuramoto, 1975). Относительно низкий Q ₁₀ указывает на то, что температура оказывает меньшее влияние на скорость развития по сравнению с другими видами, что обеспечивает дополнительную поддержку широкой термостойкости P. hypochondriaca .В совокупности результаты выживаемости и скорости развития подчеркивают эвритермическую природу эмбрионов и позволяют предположить, что P. hypochondriaca , вероятно, вызовет наименьшее беспокойство, даже если температура воздуха повысится на 1,6–4,4 ° C, а температура воды — на 0,5–2,5. ° C к 2099 году, как это прогнозируется различными климатическими моделями для южной Калифорнии (Cayan et al., 2008; van Vliet et al., 2013).

Несмотря на влияние температуры на скорость развития, температура имела ограниченное влияние на массы на протяжении всего эмбрионального развития (рис. 3).Этот результат не подтверждает нашу гипотезу о том, что более теплые эмбрионы будут меньше при вылуплении, как это наблюдалось у других видов земноводных и рыб (Rombough, 1988; Kamler et al., 1998; Mueller et al., 2015b; Eme et al., 2018). Однако другие виды также не показали изменения массы тела с температурой, так что это не уникальное явление для P. hypochondriaca (Watkins and Vraspir, 2005; Mueller et al., 2011). В то время как влажная масса эмбриона увеличивалась на протяжении всего эмбрионального развития, это происходило в основном из-за увеличения содержания воды, а увеличение сухой массы наблюдалось только при вылуплении.Напротив, масса как влажного, так и сухого желтка уменьшилась, в то время как содержание воды в желтке было относительно стабильным. Отсутствие существенного соматического роста до вылупления наблюдается у других земноводных (Mitchell, 2001; Mueller et al., 2012). Ограниченный рост на этих стадиях, вероятно, ограничит влияние температуры на распределение энергии по массе. Однако мы не наблюдали различий в массе личинок при измерении V˙O ₂ и CTMax личинок, и поэтому ограниченное влияние температуры на массу, по-видимому, сохраняется на протяжении всего развития личинок при исследованных температурах.

Вопреки нашей гипотезе, масс-специфический V˙O ₂ увеличивался на протяжении эмбрионального развития при более высоких температурах, и это соответствовало увеличению скорости развития (Рис. 4). Общие значения Q ₁₀ для скорости развития (2,5) и масс-специфического V˙O ₂ (2,1) были аналогичными, что указывает на сопоставимую температурную чувствительность для этих двух важных скоростей развития. Таким образом, непосредственное воздействие температуры на эмбриональное развитие, а именно более быстрое развитие при повышенной температуре, в значительной степени коррелирует с повышенным потреблением энергии.По-видимому, не происходит снижения энергоэффективности при разработке при более высоких температурах. Эти результаты также показали, что температуры до 25 ° C, по-видимому, не оказали существенного немедленного отрицательного воздействия на эмбрионов P. hypochondriaca . Изучение распределения энергии во время развития для таких процессов, как развитие, рост и поддержание, которые могут быть смоделированы с помощью теории динамического баланса энергии (Mueller et al., 2012), будет плодотворной областью будущих исследований этого вида.

Взаимодействие температуры эмбриона и температуры акклиматизации личинок

Наше исследование функции личинок выявило влияние температуры акклиматизации личинок и стойкое влияние температуры эмбриона. Мы исследовали как масс-специфические V˙O ₂ , так и CTMax во время дифференцировки задних конечностей и пальцев стопы [Gosner (1960), стадии 32–36] при всех температурных режимах. По характеру температуры, влияющей на скорость развития, период акклиматизации до достижения этих стадий был короче при более высоких температурах, и есть вероятность, что это могло повлиять на наблюдаемые результаты.Однако у P. hypochondriaca наблюдаются вариации в продолжительности развития личинок в зависимости от температуры (Мюллер, неопубликованные данные), и каждое измеренное животное акклиматизировалось к своей личиночной температуре в течение как минимум 2 недель. Вместо этого мы предположили, что статус развития индивидуума с большей вероятностью будет влиять на функцию, и поэтому мы провели наши измерения в узком диапазоне стадий развития, что привело к сопоставимым размерам личинок при разных обработках.

Устойчивые эффекты окружающей среды эмбриона на массово-специфический V˙O личинки ₂ или CTMax зависели от температуры акклиматизации личинок, причем оба измерения подтверждали эффект «чем теплее, тем лучше» от температуры инкубации эмбриона (Huey et al., 1999). Массово-специфический V˙O ₂ личинки, измеренный после акклиматизации к 20 ° C, не показал значительных устойчивых эффектов эмбриональной температуры (рис. 5А). Однако при температуре акклиматизации 25 ° C мы наблюдали, что личинки, инкубированные при 10 ° C в качестве эмбрионов, имели пониженный масс-специфический V˙O ₂ по сравнению с личинками, инкубированными при 15 ° C. Этот результат противоречит нашей гипотезе о том, что инкубация эмбриона при более низких температурах вызовет более высокий масс-специфический V˙O ₂ на более поздних стадиях развития (т.е.е., «холоднее — лучше»). Наши данные показали, что удельный вес личинок V˙O ₂ либо увеличивается, либо не изменяется при более высокой температуре акклиматизации личинок 25 ° C по сравнению с 20 ° C. Seebacher и Grigaltchik (2014) показали, что личинок Limnodynastes peronii показали более высокий V˙O ₂ при акклиматизации к 15 ° C по сравнению с 25 ° C, особенно при измерениях при 20, 25 и 30 ° C (Seebacher and Grigaltchik, 2014). ). Температуры акклиматизации в настоящих исследованиях различались всего на 5 ° C по сравнению с 10 ° C, используемыми Seebacher and Grigaltchik (2014), и общей тенденцией в P.hypochondriaca было связано с более высокой температурой акклиматизации, приводящей к более высокому V˙O ₂ . Возможно, что разные периоды акклиматизации личинок (~ 2–8 недель для этого исследования, 6 недель для L. peronii ) могут привести к различным наблюдениям за влиянием температуры инкубации эмбрионов на V˙O ₂ .

Также возможно, что любые стойкие эффекты температуры инкубации эмбрионов зависят от вида и / или признака. Только настоящее исследование и Seebacher and Grigaltchik (2014) измеряли несколько показателей продуктивности животного или ферментативных данных, и оба исследования показывают отдельные зависимые переменные, которые поддерживают либо более холодный (Seebacher and Grigaltchik, 2014 V˙O ₂ и аэробные ферментные анализы), либо более теплый (Seebacher and Grigaltchik, 2014 анаэробные ферментные анализы; и настоящее исследование, V˙O ₂ ) температуры инкубации, обеспечивающие более высокий фенотип потребления энергии для личинок.Seebacher и Grigaltchik (2014) также показали стабильно более высокие значения для характеристики работоспособности (скорости плавания) после инкубации эмбрионов в более теплой среде, что аналогично нашим результатам для данных V˙O ₂ и CTMax. Тем не менее, R. sylvatica , которые развивались при более низких температурах, плавали быстрее, чем инкубированные более теплые эмбрионы, при измерении как личинки, что позволяет предположить, что более низкие температуры лучше подходят для измерения продуктивности личинок (Watkins and Vraspir, 2005).

Подобно массовому VO ₂ , взаимодействие между температурой эмбриона и температурой акклиматизации личинок привело к изменениям термостойкости личинок.Большинство обработок в настоящем исследовании показали, что акклиматизация к более высокой температуре дала большую термостойкость личинкам P. hypochondriaca (Рисунок 5B). При температуре акклиматизации личинок 20 ° C личинки инкубировали при 20 ° C, поскольку у эмбрионов был самый низкий CTMax, что значительно ниже, чем у личинок, инкубированных при 25 ° C в качестве эмбрионов. Фактически, CTMax личинок, инкубированных при 25 ° C в качестве эмбрионов, было относительно высоким по сравнению с другими видами обработки при этой температуре акклиматизации, и существенно не отличалось от CTMax, измеренного при 25 ° C.Эти личинки были единственной обработкой, при которой переход от температуры эмбриона к температуре личинки был связан с понижением температуры, а не с повышением или отсутствием изменений. Повышенная температура эмбриона, по-видимому, привела к более высокой термостойкости, которая сохранялась даже после акклиматизации личинок к более низким температурам. Таким образом, эта обработка подтвердила нашу гипотезу о том, что повышение температуры эмбриона приведет к повышению термостойкости личинок. В будущих экспериментах можно будет изучить снижение температуры личинок по сравнению с эмбриональной температурой, чтобы получить представление о влиянии на термостойкость.

Термическая толерантность личинок P. hypochondriaca находится в пределах диапазона, измеренного у аналогичных видов, но более чувствительна к акклиматизации по сравнению с предыдущими исследованиями. Наши значения CTMax при температуре акклиматизации 20 ° C (38–39 ° C) были аналогичны Pseudacris triseriata , R. sylvatica , R. temporaria и Xenopus laevis , но ниже значений (41 –43 ° C) наблюдается у Bufo americanus , B. woodhousei , B.marinus и Gastrophryne carolinenus при одинаковой температуре акклиматизации (Cupp, 1980; Floyd, 1983; Sherman, Levitis, 2003; Enriquez-Urzelai et al., 2019). Таким образом, термостойкость личинок P. hypochondriaca имеет тенденцию соответствовать другим видам, размножающимся в зимние месяцы. При проведении эмбриональных обработок повышение температуры акклиматизации на 5 ° C приводило к увеличению CTMax в среднем на 1,8 ° C (наклон изменения температурного допуска на каждый 1 ° C повышения температуры акклиматизации = 0.36). Это больший прирост толерантности, чем у других видов. Например, при измерении на тех же стадиях развития R. temporaria набирает 0,8 ° C при повышении температуры акклиматизации на 7 ° C (наклон = 0,11), в то время как R. catesbeiana и B. marinus прибавляют примерно 0,7 ° C. и 1 ° C, соответственно, при повышении температуры акклиматизации на 10 ° C (наклон = 0,07 и 0,1 соответственно) (Menke, Claussen, 1982; Floyd, 1983; Enriquez-Urzelai et al., 2019).Проведение аналогичных экспериментов с видами, диапазон температур которых различается во время развития, может помочь полностью понять эффекты акклиматизации и потенциальные эффекты переноса температуры на термостойкость.

Сводка

Это исследование подтвердило термостойкую природу P. hypochondriaca на эмбриональной и личиночной стадиях жизни, и мы продемонстрировали, что эмбриональная среда может иметь устойчивые эффекты на личиночной стадии. Мы наблюдали, что температура эмбриона 10 ° C приводила к снижению V˙O ₂ при температуре акклиматизации личинок 25 ° C, тогда как CTMax была выше у личинок, инкубированных при 25 ° C и акклиматизировавшихся к 20 ° C.Таким образом, при каких условиях переходящие эффекты температуры развития проявляются в фенотипе, вероятно, будут зависеть от признака. Остается неясным, каковы последствия изменений в использовании энергии и термостойкости для P. hypochondriaca за пределами личиночной стадии. В будущих исследованиях следует изучить фенотипы в процессе метаморфического перехода, чтобы увидеть, возникают ли эффекты переноса даже после значительных морфологических и физиологических изменений, таких как те, которые происходят во время метаморфоза амфибий.Более высокие температуры личинок обычно вызывают более мелкие и более молодые метаморфы (см. Метаанализ Ruthsatz et al., 2018), но функциональные последствия этого за пределами метаморфоза неясны; в нашем настоящем исследовании высокая температура инкубации эмбрионов не повлияла на размер вылупившихся особей этих эвритермальных лягушек. Было показано, что плотность личинок влияет на размер и морфологию пищеварительной системы после метаморфоза (Bouchard et al., 2016; Yagi and Green, 2018). Недавнее исследование R. temporaria предполагает, что термостойкость личинок может не сохраняться после метаморфоза, и, следовательно, воздействие температуры воды во время развития личинок может не оказывать защитного или вредного воздействия на молодь (Enriquez-Urzelai et al., 2019).

Для выяснения общих закономерностей фенотипических реакций на температуру развития необходимы будущие исследования физиологии у нескольких видов земноводных. Наше исследование частично подтвердило эффект «чем теплее, тем лучше» от температуры инкубации эмбриона (аналогичный или более высокий V 90O ₂ и CTMax для личинок, инкубированных в более теплых эмбриональных условиях), тогда как Seebacher и Grigaltchik (2014) продемонстрировали поддержку того, что «чем холоднее, тем лучше». лучше »(более высокая активность V˙O ₂ и аэробных ферментов для личинок, инкубированных в более холодных эмбриональных условиях (Huey et al., 1999; Сибахер и Григальчик, 2014). В дальнейшем для понимания факторов, влияющих на стойкие фенотипические изменения, необходимы сравнения стенотермных видов с эвритермическими, а также исследования с участием земноводных, которые различаются по своим географическим ареалам и температурам, с которыми они сталкиваются во время развития. Земноводные с ограниченным географическим распространением демонстрируют повышенную реакцию на стресс по сравнению с универсальными видами с более широким распространением (Assis et al., 2018), и вполне вероятно, что стенотермные амфибии также могут демонстрировать более стойкие стойкие фенотипические изменения в ответ на температуру по сравнению с эвритермическими видами, такими как П.Ипохондрия . Изучение влияния температуры развития на жизненный цикл многих видов даст нам более полное представление о том, как температура формирует фенотипы, и это будет неоценимо для прогнозирования реакции видов на изменение климата.

Доступность данных

Наборы данных, созданные для этого исследования, доступны по запросу соответствующему автору.

Это исследование было проведено в соответствии с рекомендациями Управления по благополучию лабораторных животных, Национальных институтов здравоохранения и Комитета по институциональному уходу и использованию животных Калифорнийского государственного университета Сан-Маркос.Протокол был одобрен Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Калифорнийского государственного университета Сан-Маркос.

Авторские взносы

CM задумал и разработал исследование, провел эксперименты и написал рукопись. JB, LK и SM провели эксперименты и сопоставили данные. Все авторы одобрили окончательную версию рукописи.

Финансирование

Эта работа была частично поддержана стартапами от Калифорнийского государственного университета Сан-Маркос для CM.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим Джона Эма и двух рецензентов за их полезные комментарии к более ранней версии этой рукописи. Мы также благодарим Департамент рыб и дикой природы Калифорнии за научное разрешение на сбор яиц (разрешение № 13473).

Список литературы

Ассис В. Р., Титон С. М. и Гомес Ф. Р. (2018). Острый стресс, уровень стероидов в плазме крови и врожденный иммунитет у бразильских жаб. Gen. Comp. Эндокринол. 273, 86–97. DOI: 10.1016 / j.ygcen.2018.05.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бушар, С. С., О’Лири, К. Дж., Варгелин, Л. Дж., Шарбонье, Дж. Ф., и Варкентин, К. М. (2016). Постметаморфические переходящие эффекты пластичности пищеварительной системы личинок. Функц. Ecol. 30, 379–388. DOI: 10.1111 / 1365-2435.12501

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Брэдфорд, Д. Ф. (1990). Время инкубации и скорость эмбрионального развития у земноводных: влияние размера яйцеклетки, температуры и репродуктивного режима. Physiol. Zool. 63, 1157–1180. DOI: 10.1086 / Physzool.63.6.30152638

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Браттстрем Б. Х. и Уоррен Дж. У. (1955). Наблюдения за экологией и поведением тихоокеанской древесной лягушки. Hyla regilla . Копея 1955, 181–191.

Google Scholar

Каян, Д. Р., Маурер, Э. П., Деттингер, М. Д., Тайри, М., и Хейхо, К. (2008). Сценарии изменения климата для региона Калифорния. Клим. Измените 87, 21–42. DOI: 10.1007 / s10584-007-9377-6

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Коэн, Дж. М., Чивителло, Д. Дж., Венески, М. Д., МакМахон, Т. А., и Рор, Дж. Р. (2018). Взаимодействие между изменением климата и инфекционными заболеваниями привело к массовому сокращению численности земноводных. Global Change Biol. 25, 927–937. DOI: 10.1111 / gcb.14489

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Каннингем, Дж. Д., и Маллалли, Д. П. (1956). Термические факторы в экологии тихоокеанской древесной лягушки. Herpetologica 12, 68–79.

Google Scholar

Купп, П. В. Младший (1980). Термическая толерантность пяти соленых земноводных в процессе развития и метаморфоза. Herpetologica 36, 234–244.

Google Scholar

Эме, Дж., Мюллер, К. А., Ли, А. Х., Мелендес, К., Манзон, Р. Г., Сомерс, К. М. и др. (2018). Ежедневные повторяющиеся колебания температуры инкубации эмбрионов изменяют метаболизм и рост озерного сига ( Coregonus clupeaformis ). Сост. Biochem. Physiol. А 226, 49–56. DOI: 10.1016 / j.cbpa.2018.07.027

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эме, Дж., Мюллер, К. А., Манзон, Р. Г., Сомерс, К. М., Борехэм, Д. Р., Уилсон, Дж. Ю. (2015).Критические окна в эмбриональном развитии: изменение температуры инкубации влияет на частоту сердечных сокращений и потребление кислорода эмбрионами и вылупившимися детенышами озерной сиг ( Coregonus clupeaformis ). Сост. Biochem. Physiol. А 179, 71–80. DOI: 10.1016 / j.cbpa.2014.09.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Энрикес-Урселаи, У., Сакко, М., Паласио, А.С., Пинтанель, П., Техедо, М., и Ничеза, А.Г. (2019). Онтогенетическое снижение термостойкости не устраняется более ранней акклиматизацией развития у Rana temporaria . Oecologia 189, 385–394. DOI: 10.1007 / s00442-019-04342-y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Флойд Р. Б. (1983). Онтогенетическое изменение температурной толерантности личинки Bufo marinus (Anura: Bufonidae). Сост. Biochem. Physiol. А 75, 267–271. DOI: 10.1016 / 0300-9629 (83) -6

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Госнер, К. Л. (1960). Упрощенная таблица для стадирования эмбрионов и личинок бесхвостых амур с примечаниями по идентификации. Herpetologica 16, 183–190.

Google Scholar

Харки, Г. А., и Семлич, Р. Д. (1988). Влияние температуры на рост, развитие и полиморфизм окраски декоративной хористой лягушки Pseudacris ornata . Копея 1988, 1001–1007.

Google Scholar

Хьюи, Р. Б., Берриган, Д., Гилкрист, Г. У., и Херрон, Дж. К. (1999). Проверка адаптивного значения акклиматизации: сильный вывод. г.Zool. 39, 323–336. DOI: 10.1093 / icb / 39.2.323

CrossRef Полный текст | Google Scholar

МГЭИК (2014). «Изменение климата 2014: сводный отчет» в Труды Рабочих групп I, II и III к Пятому оценочному докладу Межправительственной группы экспертов по изменению климата . редакторы Р. К. Пачаури и Л. А. Мейер (Женева: МГЭИК).

Google Scholar

Джеймсон Д. Л., Тейлор В. и Маунтджой Дж. (1970). Метаболическая и морфологическая адаптация к гетерогенной среде тихоокеанской древесной жабы, Hyla regilla . Evolution 24, 75–89. DOI: 10.1111 / j.1558-5646.1970.tb01741.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Камлер Э., Кекеис Х. и Бауэр-Немешкал Э. (1998). Температурные изменения выживаемости, развития и разделения желтка у Chondrostoma nasus . J. Fish Biol. 53, 658–682. DOI: 10.1111 / j.1095-8649.1998.tb01009.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ким, С.-Й., Меткалф, Н.Б., да Силва, А., Веландо, А. (2017). Температурные условия в молодом возрасте влияют на сезонные материнские стратегии трехиглой колюшки. BMC Ecol. 17:34. DOI: 10.1186 / s12898-017-0144-x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Менке М. Э. и Клауссен Д. Л. (1982). Термическая акклиматизация и закаливание головастиков лягушки-быка, Rana catesbeiana . J. Therm. Биол. 7, 215–219. DOI: 10.1016 / 0306-4565 (82)