Осмотический конфликт это: Презентация на тему: Онкотическое давление

Содержание

Презентация на тему: Онкотическое давление

– осмотическое давление, создаваемое за счет наличия белков в биожидкостях организма и составляет 0,5% от общего осмотического давления плазмы ( 0.025 – 0.04 атм )

Разрушение белков при гнойных процессах сильно увеличивает величину онкотического давления.

При заболеваниях, сопровождающихся уменьшением концентрации белков крови, онкотическое давление падает. Возникают так называемые онкотические отеки подкожной клетчатки.

Онкотическое давление играет важную роль в процессах всасывания жидкости из тканей в кровеносные сосуды. 52

Физиологические растворы

0,9%-ный ( 0,15 М ) раствор NаСl и 5% — ный ( 0,3М ) раствор глюкозы создают такое же давление являющиеся, следовательно, изотоническими по отношению к крови.

Истинно физиологическими !!!

считаются растворы, включающие соли, белки и другие вещества в пропорциях, соответствующих их содержанию в крови человека и используемые в аппарате «искусственная почка»

Изоосмия

Изоосмия — постоянство осмотического давления физиологических сред (фундаментальное физико-химическое требование гомеостаза).

Нарушение изоосмии оказывается губительным для организма гораздо раньше, чем наступает плазмолиз или лизис клеток.

Понижение осмотического давления (избыток воды, потеря солей) вызывает рвоту, судороги, затемнение сознания, вплоть до гибели организма.

Повышение же осмотического давления (потеря воды, избыток солей) вызывает их отеки, в первую очередь подкожной клетчатке.

Изо-, гипер- и гипотонические растворы

Изотонические — с одинаковым осмотическим давлением (0.9%)

Гипертонические — с большим осмотическим давлением (>0.9%)

Гипотонические — с меньшим осмотическим давлением (<0.9%)

Во всех случаях, когда в кровяное русло, мышечную ткань, спинномозговой канал в терапевтических целях вводят растворы, необходимо избегать «осмотического конфликта».

Осмотический стресс (конфликт) : пребывание в воде, которая либо неестественно богата минеральными веществами, либо, наоборот, неестественно бедна ими. Осмотический стресс имеет более серьезные последствия для рыб тех видов, которые в природе обитают в водоемах, богатых минеральными веществами, а в аквариуме их держат в воде, крайне бедной этими веществами, так что осмотическая разница между рыбой и окружающей средой значительно увеличивается.

Такие рыбы имеют менее эффективную систему осмотической регуляции, чем те, которые физиологически адаптированы к жизни в воде, бедной минеральными веществами. Поэтому они не способны справиться с возникающими в результате подобных условий перегрузками осморегулирующей системы.

В случае осмотического стресса концентрацию растворенных солей следует изменять постепенно в течение 1-2 недель, чтобы избежать осмотического

Осмотический шок: внезапное изменение концентрации растворенных солей — например, если рыбу без постепенной акклиматизации пересаживают из воды, бедной минеральными солями, в воду, богатую минеральными солями (или наоборот). Это приводит к смерти рыбы в течение 2-3 суток и часто является причиной высокой смертности среди недавно приобретенных рыб у невежественных или равнодушных аквариумистов.

Лечение. Приведите содержание минеральных солей в воде к уровню, приемлемому для данного вида рыб.

В случае осмотического шока это соответствие должно быть полным, а установить его нужно немедленно. Недавно приобретенных рыб, если они явно поражены, лучше перевести в другой аквариум с подходящим химическим составом воды (например, в карантинный аквариум, где они в любом случае должны какое-то время находиться!), вместо того чтобы изменять химический состав воды в основном аквариуме, так как это может вызвать осмотический шок у рыб, уже живущих там. Потом воду в карантинном аквариуме можно постепенно, в течение 2-3 недель, привести в соответствие с водой в основном аквариуме и тогда перевести новых рыб в

их постоянное жилище.

58

 

Изменения, происходящие с кровяными тельцами в растворах NaCl различной концентрации

При введении гипертонических наблюдается:

1)осмотический шок

2)осмотический конфликт

3)флуороз

4)ацидоз

5)Алкалоз

При введении гипотонических растворов наблюдается:

1)осмотический шок

2)осмотический конфликт

3)ацидоз

4)алкалоз

5)флуороз

Рабочие «горячих» цехов должны пить подсоленную воду, так как в результате повышенного потоотделения осмотическое давление у них понижается !

Лизис, плазмолиз, гемолиз.

Лизис — разрыв клетки при введении гипотонического по отношению к крови раствора

Гемолиз — разрыв эритроцитных оболочек при введении гипотонического по отношению к крови раствора

Плазмолиз — обезвоживание эритроцитов при введении гипертонического по отношению к крови раствора

Начальная стадия гемолиза происходит при снижении осмотического давления до 3,5–3,9 , а полный гемолиз при 2,5- 3,0 атм61.

осмотический шок — это… Что такое осмотический шок?

осмотический шок
осмотический шок


1) нарушения в клетке, возникающие при переносе ее в гипертонический или гипотонический раствор; 2) метод разрушения клеток микроорганизмов, основанный на погружении их (обычно после удаления

клеточной стенки) в дистиллированную воду или буфер низкой концентрации. В результате насыщения клетки водой происходит разрыв цито–плазматической мембраны и ее содержимое выходит вводу или буфер.

(Источник: «Микробиология: словарь терминов», Фирсов Н.Н., М: Дрофа, 2006 г.)

Осмотический шок

повреждение или распад клеток, вызванные помещением их в гипотоническую или гипертоническую среду. Используют для получения компонентов клетки из грам- бактерий. Первоначально клетки суспендируют в буферной гипертонической среде, содержащей ЭДТА, затем их быстро переносят в охлажденную гипотоническую среду (на льду), центрифугируют, надосадок сливают, ЭДТА добавляют с целью разрушить липополисахариды клеточной стенки. В менее выраженной форме (с потерей способности к размножению) О.ш. у некоторых бактерий наступает при переносе теплой к-ры в холодный разбавитель.

(Источник: «Словарь терминов микробиологии»)

.

  • осмотический потенциал
  • осмотическое давление

Смотреть что такое «осмотический шок» в других словарях:

  • Криотерапия — (от Крио. .. и Терапия)         лечение холодом. С лечебной целью издревле применяли обкладывания льдом, обёртывания в смоченные водой простыни. Умеренное, не вызывающее оледенения охлаждение используется в медицине с целью уменьшения… …   Большая советская энциклопедия

  • Экстракт (биология)

    — Экстракт (клеточный экстракт, бесклеточная система)  разрушенные механическим или химическим (осмотический шок) способом клетки, использующиеся для воспроизведения биохимических процессов «в пробирке». Для получения экстрактов используются клетки …   Википедия

  • Клеточный экстракт — У этого термина существуют и другие значения, см. Экстракт. Экстракт (клеточный экстракт, бесклеточная система)  разрушенные механическим или химическим (осмотический шок) способом клетки, использующиеся для воспроизведения биохимических… …   Википедия

  • Экстракт (значения) — Основная статья: Экстракция Клеточный экстракт  разрушенные механическим или химическим (осмотический шок) способом клетки, использующиеся для воспроизведения биохимических процессов «в пробирке» Экстракт  концентрированное извлечение… …   Википедия

  • Реанимацио́нная патоло́гия — осложнения, возникающие при проведении реанимации и интенсивной терапии терминальных состояний (Терминальные состояния). Иногда эти осложнения являются непосредственной причиной смерти больных, оттесняя на задний план основное заболевание,… …   Медицинская энциклопедия

  • Поно́сы — (diarrhoea, единственное число; синоним диарея) опорожнение кишечника с выделением жидких каловых масс. При П. стул обычно учащен более 2 раз в сутки. Суточное количество кала превышает 200 г, содержание воды в нем увеличивается до 95% (в норме… …   Медицинская энциклопедия

  • Сахарный диабет 2-го типа — Сахарный диабет 2 го типа …   Википедия

  • Желатин (лекарственное средство) — (Gelatine) Действующее вещество Желатин Классификация Фарм. группа Заменители плазмы и других компонентов крови …   Википедия

Растворы. Коллигативные свойства растворов. — КиберПедия

Растворы. Коллигативные свойства растворов.

1. При введении больному 20%-ного раствора глюкозы наблюдается:

Осмотический шок

Осмотический конфликт

Изменения осмотического давления не происходит

Повышение рН крови

2. Осмотическое давление крови составляет при 37°С:

КПа

КПа

КПа

КПа

3. Будут ли изотоническими 10%-ные растворы глюкозы и фруктозы?

Да

Нет

Будут осмолярными

Будут осмоляльными

4. В 5%-ном растворе глюкозы эритроциты будут:

Находиться в равновесном состоянии

Подвергаться гемолизу

Подвергаться плазмолизу

Подвергаться лизису

5. Степень диссоциации слабого электролита, уменьшается при:

Добавлении одноименного иона

Увеличением температуры

Разбавлении

Увеличении давления

6.

Уравнение  называется законом:

Выпаривания Оствальда

Отведения Оствальда

Разведения Оствальда

Смешивания Оствальда

7. Коэффициент активности иона не зависит от:

Концентрации иона

Температуры

Концентрации других ионов

Давления

8. Математическое выражение коэффициента активности — это уравнение:

Галлера

Смолуховского

Дебая-Хюккеля

Генри

9. Физиологический раствор – это:

1) 1% раствор карбоната натрия

2) 1% раствор хлорида натрия

3) 0,9% раствор карбоната натрия

4) 0,9% раствор хлорида натрия

10. Смешали 300г 15% и 200г 25% растворов глюкозы. Массовая доля вещества в полученном растворе равна:

1 ) 15 %

2 ) 18 %

3 ) 20 %

4 ) 19 %

11. К 100 г 5% NaCl добавили 150 г воды. Массовая доля вещества в растворе составляет:

1 )3 %

2 ) 2 %

3 ) 4 %

4 ) 8 %

Морской водой нельзя утолить жажду, так как по отношению к биологическим жидкостям она:

Изотонична

Гипотонична

Гипертонична

Токсична

13. Опишите поведение эритроцитов в 0,5%-ном растворе NaCl. Каким будет этот раствор по отношению к плазме крови?

Гемолиз, гипотоническим

Плазмолиз, гипотоническим

Гемолиз, гипертоническим

Плазмолиз, гипертоническим

14. Рабочие «горячих» цехов должны пить подсоленную воду, так как в результате повышенного потовыделения осмотическое давление у них:

Понижается

Повышается

Не изменяется

Сначала понижается, затем повышается

15. При введении гипотонических растворов наблюдается:

Осмотический шок

Осмотический конфликт

Ацидоз

Алкалоз

16. В 20%-ном растворе глюкозы эритроциты будут:

Находиться в равновесном состоянии

Подвергаться гемолизу

Подвергаться плазмолизу

Подвергаться лизису

17. 5%-ный раствор NaCl является по отношению к плазме крови:

Гипотоническим

Гипертоническим

Изотоническим

Осмоляльным

18. Физиологический раствор по отношению к сыворотке крови является:

Изотоническим

Гипотоническим

Гипертоническим

Антагонистом

19. Зимой посыпают солью дороги для того, чтобы:

Повысить температуру таяния льда

Понизить температуру таяние льда

Температура таяния льда не меняется

Сначала повысить, затем уменьшить

20. Относительное понижение давления пара над раствором пропорционально:

Молярной доле растворенного вещества

Молярной концентрации растворенного вещества

Моляльной концентрации растворенного вещества

Молярной доле растворителя

21. Повышение температуры кипения и понижение температуры замерзания пропорционально:

Молярной концентрации

Моляльной концентрации

Молярной концентрации эквивалента

Молярной доле растворенного вещества

22. Только слабые электролиты перечислены в ряду:

1) NH4OH, H2S, H2SO3

2) H2CO3, NaCl, CH3COOH

3) HClO, KOH, MgSO4

4) CaCl2 , H2Te, HI

23. Электролитом не является:

Расплав КОН

Азотная кислота

Раствор NaOH

Этиловый спирт

24. Степень диссоциации в растворах слабых электролитов – это отношение:

Увеличивается

Уменьшается

Не зависит от концентрации

Концентрации

Разбавления

Давления

27. Концентрация иона SO 42- в 0,01 м растворе соли Al 2 ( SO 4 )3:

М

М

М

М

28. С увеличением ионной силы раствора коэффициент активности иона в уравнении :

Уменьшается

Увеличивается

Не изменяется

М

М

М

М

30. При некоторых заболеваниях в кровь вводят 0,89% NaCl. Определите массу соли, введенную в организм при вливании 400 мл этого раствора (плотность раствора 1г/ мл) .

1) 35,6

2) 0,356

3) 3,56

4) 3,6

Г NaCl и 99,11 г воды;

Г NaCl и 98,11 г воды;

Г NaCl и 91,1 г воды;

Г NaCl и 99,911 г воды.

32. Рабочие «горячих» цехов должны пить подсоленную воды, так как в ре­зультате повышенного потоотделения осмотическое давление у них:

Понижается

Повышается

Не меняется

Гемолиз, гипотоническим

Плазмолиз, гипотоническим

Гемолиз, гипертоническим

Плазмолиз, гипертоническим

Уменьшают

Увеличивают

Не изменяется

Осмотический шок

Осмотический конфликт

Флуороз

Ацидоз

38. Температура кипения децимоляльного раствора KCL по сравнению с децимоляльным раствором сахарозы:

Выше

Ниже

Их температуры одинаковы

Зависит от давления

39. В 2%-ном растворе глюкозы эритроциты будут:

Подвергаться гемолизу

Подвергаться плазмолизу

Подвергаться лизису

40. Осмос – это направленный самопроизвольный переход молекул растворителя через мембрану из:

Зависит от температуры

Зависит от объема

41. Только сильные электролиты перечислены в ряду:

1) H2S, HCl, H2SO4

2) HClO4,KCl, HNO3

3) HCN, CH3COOH, NH4OH,

4) NaOH, H2Se, HI

42. Электрический ток не проводят водные растворы:

Ацетата Na

Хлорид метиламмония

Муравьиной кислоты

Глицерина

43. Диссоциацию глюкозы описывает уравнение:

1) С6Н12О6 → 6С4++12Н+ + 6О2-

Глюкоза не диссоциирует

3) С6Н12О6 → 12Н+ + 6СО

4) С6Н12О6 → 6С4+ + 6Н2О

44. Степень диссоциации слабого электролита увеличивается при:

Разведении раствора

Охлаждении раствора

45. Константа диссоциации слабого электролита не зависит от:

Природа электролита

Полярности растворителя

Температуры

Концентрации вещества

46. Коэффициент активности иона тем больше, чем:

Ионная сила раствора – это:

М раствор глюкозы

М раствор карбоната натрия

3) 0,9% раствор хлорида натрия

4) 1,9% раствор хлорида натрия

50. Смешали 200г 20%-ного и 300г 10%-ного растворов глюкозы. Массовая доля вещества в полученном растворе равна в %:

1)15

2)16

3)18

4 )14

51. Раствор, содержащий 20 г вещества в 400 г воды кипит при температуре 100,22 °С (К H2O = 0,52 град.·кг/ моль). Молярная масса растворенного вещества равна:

Г/моль

Г/моль

Г/моль

Г/моль

52. Молярная масса вещества 40 г/моль. Ккр=1.86. Температура замерзания раствора, состоящего из 300 г воды и 20 г растворенного вещества, составляет:

1) -2 .7 0С

2) -1 .7 0С

3) -3 .1 0С

4 ) -0.93 0С

53. При введении больному 20%-ного раствора глюкозы наблюдается:

Осмотический шок

Осмотический конфликт

Повышение рН крови

54. Осмотическое давление крови составляет при 37°С:

КПа

КПа

КПа

КПа

55. Температура замерзания сантимоляльного раствора NaCI по сравнению с сантимоляльным раствором глюкозы:

Выше

Ниже

Зависит от давления

56. Будут ли изотоническими 10%-ные растворы глюкозы и фруктозы?

Да

Нет

Будут осмолярными

Будут осмоляльными

57. В 5.4%-ном растворе глюкозы эритроциты будут:

Подвергаться гемолизу

Подвергаться плазмолизу

Подвергаться лизису

58. Осмотическое давление пропорционально:

Молярной концентрации

Моляльной концентрации

Мольной доле вещества

59. Температурой кипения жидкости является температура, при которой давление ее паров становится…

Равным внешнему давлению

Меньше внешнего давления

Больше внешнего давления

Зависит от формы сосуда

60. Криоскопические и эбуллиоскопические постоянные зависят от:

Природы растворителя

Температуры

Г.

Г.

Г.

Г.

62. Гемоглобин  ( ) и оксигемоглобин ( ) являются слабыми кислотами. Какой из анионов:  или  прочнее связывает протоны ?

1 )

2 )

Не связывают

4 )  и

63. Для приготовления физиологического раствора необходимо добавить к 100 мл воды:

Г глюкозы

2) 9 г хлорида калия ;

3) 0.09 г хлорида кальция .

4) 0.9 г хлорида натрия ;

Процентная концентрация

Уменьшается объем раствора

68. В 100 мл водного раствора содержится 36,5 г HCl . Молярная концентрация раствора равна:

М

М

М

М

69. Пациенту ввели внутримышечно 1 мл 2% раствора лекарственного препарата. Сколько мг препарата введено пациенту:

Мг

Мг

Мг.

Мг

70. Хлороводород массой 20г растворили в 180 г воды. Массовая доля вещества в полученном растворе равна:

1 ) 15%

2 ) 20%

3 ) 10%

4 ) 18%

71. В 40 г. CaCO 3 (М=100г/моль)содержится вещества карбоната кальция следующее количество:

Моль

Моль

Моль

Моль

Температуры

Зависят от формы сосуда

76. У морских животных по сравнению с пресноводными животными осмотическое давление крови:

Выше

Ниже

Одинаково

Зависит от животного

77. Физиологическим раствором является:

1 ) 2% раствор глюкозы;

2 ) 0.9% раствор хлорида натрия ;

3 ) 1.2% раствор сульфата магния .

4 ) 5% раствор молочной кислоты;

78. Температура замерзания децимоляльного раствора NaCI по сравнению с децимоляльным раствором А ICl 3

Ниже

Выше

Одинаковы

Зависит от объема

79. Раствор, содержащий 20 г вещества в 400 г воды кипит при температуре 100,11 °С (К h3O = 0,52 град.·кг/моль). Молярная масса растворенного вещества равна:

Г/ моль

Г/ моль

Г/моль

Г/моль

80. Молярная масса вещества 40 г/моль. Ккр=1.86. Температура замерзания раствора, состоящего из 300 г воды и 20 г растворенного вещества, составляет:

1 ) -2.7 0С

2 ) -1.7 0С

3 ) -3.1 0С

4 ) -0.93 0С

Растворы. Коллигативные свойства растворов.

1. При введении больному 20%-ного раствора глюкозы наблюдается:

Осмотический шок

Осмотический конфликт

Осмотическая дегидратация плодово-ягодного сырья в пищевой промышленности Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

Обзорная статья/Review article_

УДК 664.162.031.2 ~ DOI: http://doi.org/10.20914/2310-1202-2017-2-134-142_

Осмотическая дегидратация плодово-ягодного сырья в пищевой _промышленности_

Наталья А. Грибова 1 [email protected] _Людмила Г. Елисеева 1 [email protected]_

1 Российский экономический университет имени Г.В. Плеханова, Стремянный переулок, 36, г. Москва, 117997, Россия Реферат. Осмотическое обезвоживание получило больше внимание в последние годы в качестве эффективного метода для сохранения фруктов, плодов и ягод. Осмос является простым процессом и способствует переработке фруктов, плодов и ягод для сохранения исходных характеристики, а именно питательной ценности и органолептических свойств: цвет, аромат и текстура. Осмотическая дегидратация нашла широкое применение в сохранении пищевых продуктов, так как снижается активность воды в фруктах, плодах и ягодах, ведь некоторые состоят из 90% воды. Процесс осмотической дегидратации с помощью различных агентов является менее энергоемким, чем процесс сушки или замораживание, поскольку он может быть проведен при температуре окружающей среды. Осмотическая дегидратация имеет потенциальные преимущества в сохранении качества продуктов питания и в сохранении здоровых продуктов питания для обрабатывающей пищевой промышленности. Обработка включает обезвоживание фруктов, плодов и ягод с помощью осмотического агента с последующим обезвоживанием в сушильных или в замороженных установках, где содержание влаги снижается и продукт становиться более стабильным. Этот метод является процессом частичной дегидратации, для того чтобы дать продукту улучшенные качества по сравнению с обычными процессами сушки или замораживанием. Целью изучения осмотической дегидратации является, выявления преимуществ и недостатков во время обработки осмотическими агентами. Рассмотрены различные аспекты технологии осмотического обезвоживания, а именно используемые растворы, характеристики растворов, влияние переменных процессов, а также качественные характеристики осмо-дегидратированных продуктов. Изучены факторы осмотической дегидратации, которые зависят от осмотического агента, концентрации растворенного вещества, температуры раствора, времени обезвоживания, перемешивания и соотношения раствора с образцами, размера, формы и компактности продукта.

Ключевые слова: осмотическая дегидратация, осмотические агенты, концентрация, плодово-ягодное сырье, активность воды, обезвоживание

Osmotic dehydration of fruit and berry raw materials in the food _industry_

Natalya A. Gribova 1 [email protected] _Lyudmila G. Eliseeva 1 [email protected]_

1 Plekhanov Russian Economic University, Stremyanniy lane, 36, Moscow, 117997, Russia

Summary. Osmotic dehydration has recently received more attention as an effective method of preserving fruits and berries. Osmosis is a simple process that facilitates the processing of fruits and berries in order to preserve the original characteristics, namely nutritional value and organoleptic properties: color, aroma and texture. Osmotic dehydration has found wide application in the preservation of food products, as the activity of water in fruits and berries decreases, in some of them up to 90% of water is contained. The process of osmotic dehydration with the help of various agents is less energy-intensive than the process of drying or freezing, since it can be processed at ambient temperature. Osmotic dehydration has potential advantages in preserving the quality of food and in maintaining healthy food for the food industry. Treatment includes dehydration of fruits and berries by an osmotic agent followed by dehydration in dry or frozen apparatus where the moisture content decreases and the product becomes more stable. This process is a partial dewatering process to provide improved product quality compared to conventional drying processes or freezing. The purpose of studying osmotic dehydration is to identify the advantages and disadvantages in the treatment of osmotic agents. Various aspects of osmotic dehydration technology are considered, namely the solutions used, the characteristics of solutions, the effect of variable processes and the qualitative characteristics of osmo-dehydrated products. Factors of osmotic dehydration that depend on the osmotic agent, concentration of solute, temperature, time, size, shape and compactness of the material, mixing and the ratio of the solution to the samples.

Keywords: osmotic dehydration, osmotic agents, concentration, fruit and berry raw materials, water activity, dehydration

Введение

Обезвоживание фруктов, плодов и ягод является одним из устаревших методов сохранения пищевых продуктов. Осмотическое обезвоживание в последние годы получило большое внимание в качестве эффективного метода для сохранения фруктов плодов и ягод. Этот процесс имеет потенциальные преимущества для обрабатывающей пищевой промышленности, чтобы сохранить качества и целостность пищевых продуктов.

Для цитирования Грибова Н.А., Елисеева Л.Г. Осмотическая дегидратация плодово-ягодного сырья в пищевой промышленности // Вестник ВГУИТ. 2017. Т. 79. № 2. С. 134-142. аог10.20914/2310-1202-2017-2-134-142

Осмотическая дегидратация — операция, используемая для частичного удаления воды из растительных тканей путем погружения в гипертонический раствор, сахар и/или солевой раствор для снижения влажности пищевых продуктов до фактического процесса сушки [1].

Техника осмотического обезвоживания (ТОО) в основном используется для разработки новых продуктов, так как она влияет на пищевые и сенсорные свойства свежих фруктов, плодов и ягод [2-5]. ТОО также максимизирует отношение сахара к кислоте и повышает стабильность For citation

Gribova N.A., Eliseeva L.G. Osmotic dehydration of fruit and berry raw materials in the food industry. Vestnik VGUIT [Proceedings of VSUET]. 2017. vol. 79. no. 2. pp. 134-142. (in Russian). doi: 10.20914/23101202-2017-2-134-142

пигментов и текстуры во время сушки и хранения [2]. Сахарное поглощение сахаридов с низкой молярной массой (глюкоза, фруктоза и сахароза) является высоким из-за максимальной скорости диффузии молекул. Этот метод обеспечивает более мягкую обработку фруктов, плодов и ягод из-за их большого сенсорного сходства между обезвоженными и натуральными продуктами [2, 4, 5].

Осмотическое обезвоживание означает процесс, посредством которого фрукты, плоды или ягоды подвергаются длительному обезвоживанию в концентрированных сахарных сиропах для того, чтобы большую часть воды и природного сахара заменить сахарным сиропом [1].

Осмотическое обезвоживание является предпочтительным по сравнению с другими методами так как в большей степени сохраняются цвет, аромат, питательные компоненты и целостность пищевого продукта [6].

Процесс осмотической дегидратации плодово-ягодного сырья

Осмотическое обезвоживание — это процесс, основанный на погружении продукта в целом виде или его часть, в гипертонические растворы, способствующие одновременной потери воды и растворенных веществ с последующим проникновением в продукт. Этот процесс позволяет получить готовый пищевой продукт с высокой пищевой ценностью, органолептиче-скими свойствами за счет частичного удаления влаги и способствует защитному действию растворенного вещества. По сравнению с другими методами обезвоживания, этот процесс вызывает меньше повреждений клеточных стенок пищевого продукта, что позволяет сохранить питательные компоненты за счет более низких температур [7-8].

Осмотическое обезвоживание представляет собой многокомпонентный процесс диффузии, который включает в себя три типа явлений массопереноса:

• первый процесс включает в себя отток воды из ткани пищевого продукта;

• второй — перенос растворенного вещества из осмотического раствора в продукт;

• третий — вымывание из растворенных веществ тканей продукта (витамины, минеральные вещества, органические кислоты) в осмотическое решение.

Третья передача количественно незначительна по сравнению с первыми двумя типами перевода, но является существенным в отношении состава продукта. Его движущей силой является разница в осмотическом давлении растворов по обе стороны от полупроницаемых клеточных мембран [1].

Следовательно, в этом процессе поток воды из фруктов, плодов и ягод переходит в раствор, где вместе с водой некоторые минералы, витамины, фруктовые кислоты и т. д. также двигаются в направлении решения, а сахара мигрируют в направлении материала. Процесс осмотической дегидратации для плодово-ягодного сырья представлен на рисунке 1 [1].

Процесс удаление воды во время осмотической дегидратации происходит за счет диффузии и капиллярного потока, тогда как поглощение растворенного вещества или выщелачивание происходит только путем диффузии [9-10].

Изучая осмос авторы Moreira, Ispir, Devic, Bchir, Mundada и др. сосредоточили внимание на исследованиях быстрых и эффективных удалений желаемого количества воды из фруктов, плодов и ягод путем корректировки таких факторов или параметров как использование высокой концентрации осмотического раствора и изучение температур предварительной обработки [11-15].

Рисунок 1. Блок-схема осмотической дегидратации фруктов, плодов и ягод

Figure 1. Block diagram of osmotic dehydration of fruits, fruits and berries

Осмотическая концентрация — это процесс удаления воды из фруктов, плодов и ягод позволяющая быстрее проходить воде через полупроницаемые клеточные мембраны. В процессе осмоса небольшое количество фруктовых кислот удаляется вместе с водой. Это динамический процесс, в котором вода и кислоты удаляются сначала, а затем происходит медленное проникновение небольшого количества раствора, но увеличивается со временем. Поэтому характеристики продукта могут быть изменены путем регулирования температуры, концентрации сахарного сиропа, концентрации раствора осмоса, времени осмоса и т. д., для того чтобы сделать процесс осмотической концентрации быстрее [6]. Осмотический агент может быть использован в осмотической дегидратации как самостоятельно, так и в комбинации [1].

В таблице 1 представлены данные о влиянии различных осмотических агентов на ожидаемые эффекты осмотической дегидратации. Результаты исследований показывают, что осмотические агенты должны уменьшать водную активность раствора и увеличивать движущую силу, быть эффективным, удобным, нетоксичным и иметь хороший вкус, легкорастворимыми, чтобы образовать высококонцентрированный раствор. Осмотический агент не должен реагировать на

продукт и должен быть доступным. Концентрация осмотического агента играет также важную роль в осмотической дегидратации. Стоимость раствора, его совместимость с конечным продуктом и консервирующий эффект имеют первостепенное значение при выборе осмотических агентов. Наиболее часто используемыми осмотическими агентами являются глюкоза, сахароза, глицерин, сорбит, кукурузный сироп, сироп глюкозы и фруктоолигосахарид [1-2].

Таблица 1.

Влияние различных осмотических агентов на ожидаемые эффекты осмотической дегидратации

Table 1.

Effect of various osmotic agents on the process of osmotic dehydration

Осмотические агенты Osmotic agents Результаты | results

1 2

Хлорид Кальция Calcium chloride Повышает упругость нарезанных плодов и сохраняет текстуру во время хранения. Взаимодействие с аскорбиновой кислотой и диоксидом серы предотвращает потемнение плода. Использование выше 0,5% придает лучший вкус продукту. | Increases the elasticity of the sliced fruit and preserves the texture during storage. Interaction with ascorbic acid and sulfur dioxide prevents the darkening of the fetus. Using above 0.5% gives the best taste to the product.

Этанол | Ethanol Снижает вязкость и температуру замерзания осмотического раствора в процессах охлаждения и замораживания. Понижает активность воды в продукте и повышает стабильность продукта при хранении. | Reduces the viscosity and freezing point of the osmotic solution in the cooling and freezing processes. Reduces the activity of water in the product and increases the stability of the product during storage.

Сахароза | Sucrose Уменьшает изменение цвета, путем предотвращения поступления кислорода, обеспечивает стабильность пигментов и помогает удерживать летучие соединения во время сушки осмотически обработанных материалов. Придает дополнительные вкусовые качества, улучшает органолептические показатели и не изменяет основной химический состав продукта. Активность воды высокая. Позволяет длительно сохранить продукты. Имеет тенденцию кристаллизоваться при сушке. Является лучшим, удобным, и эффективным способом. | Reduces discoloration by preventing oxygen supply, ensures the stability of pigments and helps to keep volatile compounds during drying of osmotically processed materials. Gives additional flavoring qualities, improves organoleptic parameters and does not change the basic chemical composition of the product. Water activity is high. Allows you to save products for a long time. It tends to crystallize during drying. Is the best, convenient, and effective way.

Фруктоза | Fructose Увеличивает содержание сухого вещества на 50% по сравнению с сахарозой, в связи с более высоким уровнем проникновения. Активность воды конечного продукта ниже. Менее предпочтительнее чем сахароза. | Increases the dry matter content by 50% compared to sucrose, due to a higher penetration level. The water activity of the final product is lower. Less preferable than sucrose.

Инвертный сахар Invert sugar Эффективен и практически не составляет большой разницы сахарозе в скорости осмотического обезвоживания плодов при одинаковой концентрации и температуры. | It is effective and practically does not make a big difference to sucrose in the rate of osmotic dehydration of fruits at the same concentration and temperature.

Лактоза | Lactose Имеет гораздо более низкий уровень сладости, чем сахароза. Низкая растворимость в водном растворе. | Has a much lower level of sweetness than sucrose. Low solubility in aqueous solution.

Мальто декстрин Maltodextrin Может быть использован в качестве осмоса, но при более высокой концентрации или совместно с другими агентами. Менее эффективен, чем сахароза с той же концентрацией. Имеет более высокую молекулярную массу, он может быть абсорбирован так же хорошо, как и глюкоза. Высокое твердое усиление при использовании объясняется высокой характеристикой поглощения. | Can be used as an osmosis, but at a higher concentration or together with other agents. Less effective than sucrose with the same concentration. It has a higher molecular mass, it can be absorbed as well as glucose. The high solid gain at use is due to the high absorption characteristic.

Хлорид Натрия, NaCl Sodium Chloride, NaCl В основном используется для овощей, так как задерживает окислительные и ферментативные потемнения. Увеличивает движущую силу сушки. Предотвращает потемнение с помощью смеси соли и сахара. | It is mainly used for vegetables, as it inhibits oxidative and enzymatic darkening. Increases the driving force of drying. Prevents darkening with a mixture of salt and sugar.

Сахар | Sugar Непригоден в процессе осмоса из-за окислительного потемнения. Трудности в утилизации сахарного сиропа. Не используется в овощной обработке. | It is unsuitable in the process of osmosis due to oxidative darkening. Difficulties in recycling sugar syrup. Not used in vegetable processing.

Продолжение табл. 1

1 2

Сорбит| Sorbitol Имеет молекулярную массу меньше сахарозы. Хорошо растворяется в воде. Менее сладкий почти вдвое, чем глюкоза. | Has a molecular weight less than sucrose. It dissolves well in water. Less sweet almost twice than glucose.

Кукурузный сироп Corn syrup Потери воды и значение твердого усиления ниже, чем обработанные в растворе сахарозы, из-за вязкой консистенции и молекулярной массы. | The loss of water and the value of the solid gain are lower than those processed in the sucrose solution, due to the viscous consistency and the molecular weight.

Кленовый сироп Maple syrup Вакуумный импрегнированный раствор, имеющий уровень 30-40% кленового сиропа, приводит к лучшему индексу отбеливания, текстурным атрибутам и уменьшенной активности воды в высушенных плодах, чем другие сахара. | A vacuum impregnated solution having a level of 30-40% maple syrup results in a better whitening index, texture attributes and reduced water activity in dried fruits than other sugars.

Мёд | Honey Состоит из фруктозы, глюкозы, мальтозы, сахарозы и других углеводов. По сравнению с другими растворами сахара раствор мёда имеет высокую осмотическую выдержку, что позволяет быстро извлечь воду. Он также обеспечивает лучшее пластифицирующее действие, так что обработанный растительный материал обладает не хрупкой текстурой и улучшает свойства регид-ратации. | It consists of fructose, glucose, maltose, sucrose and other carbohydrates Compared with other solutions, honey has a high osmotic exposure, which allows you to quickly extract water.ги1 оценивали влияние различных осмотических агентов таких как сахароза, фруктоза, глюкоза, сорбит и мальтодекстрин на массовый расход во время осмотического обезвоживания плодов абрикоса. В результате исследований было выявлено, что сорбитол имеет молекулярную массу меньше сахарозы. Сорбитол (Сб Н14 Об) представляет собой сахарный спирт, полученный восстановлением альдегидной группы глюкозы до дополнительной гидроксильной группы. Мальтодекстрин имеет значительно более высокую молекулярную массу по сравнению с другими осмотическими агентами. Более высокое твердое усиление в случае мальто-декстрина объясняется его высокой характеристикой поглощения. Фруктоза, помимо обеспечения низкого поглощения твердых веществ, обеспечивает высокое осмотическое давление в абрикосе благодаря потенциалу связывания воды. Самые высокие потери воды были получены при использовании раствора сахарозы, соответственно. Следовательно, растворы фруктозы и сахарозы считаются лучшими при осмотическом обезвоживании абрикосов из-за сильного усиления и высоких потерь воды [12].

Исследования проводились также в области осмотического обезвоживания яблок с использованием двух растворов — сахарозный и кукурузный. В исследовании рассматривались три фактора: температура (30-50°С), концентрация сиропа (40-60%) и время погружения (90-240 мин). В результате было получено, что плоды практически соответствуют свежим

за счет максимальной потери воды и прироста твердых веществ, а также аскорбиновая кислота была выявлена в обоих растворах осмотических агентов [33].

Было также подтверждено [34], что скорость проникновения кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы выше по сравнению с сахарозой, но на основе сенсорной оценки наиболее предпочтительнее является сахароза.

В результате научных исследований доказано [1], что одним из наиболее часто используемых осмотических агентов является сахароза. Она также широко используется в качестве пищевого подсластителя. Несмотря на то, что широкое и доступное разнообразие альтернативных осмотических агентов, сахароза считается оптимальным выбором.

Влияние концентрации, температуры и времени обработки осмотического агента

Концентрация осмотического агента также влияет на кинетику передачи данных во время осмотического обезвоживания [4]. Увеличение концентрации осмотического раствора приводит к большей скорости потери воды до достижения равновесного уровня [2, 5]. Разница в осмотическом потенциале между раствором и образцом приводит к более высокой скорости диффузии растворенного вещества и воды [2, 4]. Менее концентрированный раствор сахарозы приводит к минимальной потере воды и коэффициентам твердого усиления [2, 5]. Однако влияние упрочнения высокой концентрации сахарозы может уменьшить массовый расход фруктов, плодов и ягод [4].

В своих научных трудах, Fa1ade и др. [16] изучали явление осмотического массопереноса арбузов (нарезанные в виде пластов) с использованием трех различных концентраций раствора сахарозы (40, 50 и 60°Впх). В результате было обнаружено, что потери воды и значение твердого усиления в арбузных образцах, обработанных более высокой концентрацией осмотического раствора намного выше. Аналогичным образом [12] оценивалась скорость массового переноса абрикоса во время осмотического обезвоживания. Плоды абрикосов были погружены в три различные концентрации сахарозы (40, 50 и 60%). Более высокая концентрация сахарозы приводит к большим градиентам осмотического давления, что приводит к более высокому усилению твердого тела и потере воды в течение всего периода осмотического обезвоживания.

Аналогично, было изучено влияние различных концентраций сахарозы (40, 50 и 60°Впх) на скорость переноса гранатовой кожуры при осмотической дегидратации. Гранатовая кожура, обезвоженная в растворе сахарозы 60°Вйх, показала более высокий коэффициент усиления твердого тела и потери воды по сравнению с образцами, пропитанными в осмотическом растворе 40 и 50°Впх [15].

Исследования были посвящены изучению таких факторов как вид осмотического агента в зависимости от способа тепловой обработки, температуры и продолжительности обработки ягод черной смородины, ежевики, малины и земляники садовой. Ягоды обезвоживали 60% раствором сахарозы, применяя две технологии: раствор сахарозы без тепловой и с тепловой обработкой. В результате было получено, что обезвоживание ягод в растворе сахарозы с тепловой обработкой происходит быстрее за счет выше плотности сиропа, что позволяет в большей степени сохранить целостность и структуру ягод [17].

Доказано, что температура осмотической обработки фруктов не должна превышать 50°С, так как данная температура ограничивает ухудшение вкуса, текстуры и термочувствительные соединения продукта. При температуре 49°С происходит ферментативное потемнение и ухудшение аромата плодов. Данная температура является эффективной для поддержания вязкости раствора и позволяет сохранить качество плодов без их изменения [1, 5, 10, 38].

Это подтверждается исследованиями, что ягоды с темным окрасом обработанные при температуре более 50°С на кожице появляется нежелательные изменения [1, 35-37].

Исследования проводились и в области осмотического обезвоживания ананаса в растворе сахарозы при различных температурах, концентрациях, соотношениях раствора и объекта. На основе анализа экспериментальных

данных в ходе исследований были получены наилучшие результаты влияния температур при 30, 40 и 50°С, а также концентраций сахарозы при 50, 60 и 70°Вйх в соотношении 1:4 [38].

Доказано, что осмотическое обезвоживание яблок при температуре между 30 и 50°С по сравнению с комнатной температурой происходит значительное увеличение коэффициента сахара до 55% [1, 39].

Проводился эксперимент по изучению массопереноса яблок в осмотический раствор 20 и 50% концентрации мальтодекстрина в соотношение 1:20 при температуре 30°С. Результаты показали, что яблоки, обработанные раствором, имеют больше сухого вещества и лучше сохраняют структуру, вкусовые качества в сравнении с необработанными яблоками [18].

Изучался эффект осмотической дегидратации на плодах манго путем изменения температуры обработки (30-50°С), концентрации раствора (40-60%) и времени погружения (60-150 мин). В результате было получено максимальное удаление воды (25%) с поглощением твердого тела менее чем на 6% путем поддержания подходящей комбинации раствора сахарозы (44% мас./мас.), времени обработки (80 мин) и температуры 38°С [19]. Исследовалась осмотическая дегидратация ягод с использованием трех различных осмотических агентов: сахароза (70%), сахароза + глюкоза (70% + 65%) и этанола. В результате исследований установлено, что снижается активность воды, а также приводит к элюированию аромата трехсторонне и антоциа-нина в осмотический раствор [20]. Это также существенно повлияло на содержание ликопина и аскорбиновой кислоты. Предварительная обработка повысила стабильность хранения замороженного продукта [21].

Был также изучен температурный режим при различных осмотических агентах на семенах граната. В качестве осмотических агентов были взяты сахароза, глюкоза 50°Вх и их сочетание (50:50) при различном температурном режиме (30, 40 и 50°С). Следовательно, установлено, что температурный параметр увеличивает потерю воды во время осмотической обработки продукта. Это подтверждается данными, что уже после 20 мин обезвоживания потери воды в сахарозе составило 46%, глюкозе 37%, а в растворе смеси 41% [40].

Физико-химические свойства осмотической дегидратации

На процесс осмотической дегидратации также влияют и физико-химические свойства, молекулярная масса, растворимость и ионное состояние растворенного вещества [2]. Осмотическая дегидратация служит движущей силой противоточных потоков растворенного вещества и воды, а также измеряет степень потери воды и поглощения твердых частиц. Это существенно

влияет на физические и сенсорные свойства конечного продукта. Важным критерием является это совместимость растворенного вещества с компонентами пищи [2, 5]. Осмотический агент с более низким молекулярным весом может легко проникать в клетки фруктов, плодов и ягод по сравнению с осмотическим агентом с более высокой молекулярной массой [2, 4].

Изучены и оценены различные методы предварительной обработки для осмотического обезвоживания клюквы. Было проведено механическое, химическое и осмотическое обезвоживание. В механической предварительной обработке плоды были разрезаны на половинки и четверти. При химической предварительной обработке разница заключалась в температуре химического вещества и времени погружения плодов, а при осмотической дегидратации использовалось различное осмотическое средство в разной концентрации вместе с изменяющимся временем осмотического обезвоживания. Исходя из результатов, полученных в соответствии с приростом массы, твердым усилением и влажностью, было выявлено, что клюква, нарезанная на четверть частей, показала лучший результат, а время и концентрация осмотического агента значительно способствовали результату, однако различная химическая обработка не показала различий в качестве продукта [41].

На процесс осмотического обезвоживания также влияет рН осмотического раствора. Максимальные потери воды при рН 3 для яблок, нарезанных в виде формы колец, наблюдалось с использованием кукурузного сиропа. С уменьшением рН (рН 2) текстура яблочного кольца стала более мягкой, что может быть связано с деполимеризацией и гидролизом пектина, тогда как твердость продукта сохранялась при рН 3,0-6,0 [2, 5].

Основной проблемой для улучшения осмо-обезвоженных пищевых продуктов является их микробная нагрузка, поскольку она может влиять на срок хранения упакованных продуктов, особенно нарезанных фруктов, плодов или ягод [22]. Следовательно, снижение микробной нагрузки без каких-либо дополнительных этапов обработки можно снизить за счет покрытия осмотическим агентом, при этом сохранить затраты, тем самым обеспечивая дополнительную ценность для пищевых продуктов. В результате обнаружено, что подходящая комбинация активности воды и рН может быть очень эффективной для борьбы с микробами в пище. В исследованиях было определено, что в обезвоженных яблоках предварительно обработанными кислотными растворами инактивирована кишечная палочка [2].

Комбинация низкого уровня рН и активности воды значительно снижает микробные нагрузки [23]. В результате осмотического

обезвоживания ананаса в растворе сахарозы в комбинации с лимонной кислотой (0,5-2,5%) при температуре (25-45 °С) выявлено, что потери влаги, массы и твердое усиление достигнуто 36,54; 42,62 и 92,16% соответственно, через 6 ч процесса, с уменьшением количества микробов более чем на два цикла регистрации и более высокой сенсорной восприимчивостью с определяемой оптимизацией (2,48% лимонной кислоты и 44,99 °С) [24].

Активность воды является важным параметром, который влияет на микробную экологию и очень важен для срока годности осмо-обезво-женных продуктов и определяется как доступное содержание влаги в пищевом продукте. Это подтверждается исследованиями Klewicki и др., где были изучены водная активность и содержание сухого вещества осмо-сублимированных и осмо-лиофилизированных фруктов [25].

Немаловажное значение имеет увеличение сроков годности готового переработанного продукта — это возможно сделать за счет взаимосвязи предварительно обработанных плодов, фруктов или ягод осмотическими растворами с последующей их доработкой. Осмотическая дегидратация с последующей вакуумной сушкой проводилась в пищевом материале с раствором сахарозы 65-75°Вйх до тех пор, пока вес не был потерян до 30-50%. В результате получен объемный продукт с хрустящей текстурой и по цене, которая значительно ниже, чем продукт, полученный лиофилизацией [26]. Комбинированная осмотическая и вакуумная пропитка кусочков яблок с 30-40% кленовым сиропом по сравнению с другими сахарами приводит к лучшим текстурным свойствам и индексу отбеливания, а также к снижению уровня активности воды. Исследования также были посвящены сравнению различных методов сушки и было установлено, что вакуумная сушка наиболее эффективна при сохранении цветных, текстурных и фенольных соединений во время сушки яблок [27].

Уровень давления и время его действия, концентрация и тип используемого осмотического агента, геометрическая форма, а также пористость образца обязательно должны учитываться для разработки подходящих условий для процесса импульсного вакуумного осмотического обезвоживания. Вакуум наносят в течение 10-20 мин, а затем высвобождают, что приводит к импульсным циклам вакуумной осмотической дегидратации, которые в сочетании с осмотическими градиентами развивают сжатие и релаксацию пищевой матрицы, что ускоряет осмотическое обезвоживание [28].

Проведенные исследования по вакуумной дегидратации кубиков дыни при давлении 0,01 МПа и в растворах сахарозы 40, 50 и 60°Впх. В результате использования менее вязкого

раствора в сочетании с вакуумом в начале процесса привело к более высокому усилению, однако в твердом усилении наблюдалась тенденция к уменьшению концентрации раствора [29-30]. Обработка давлением 0,7 МПа для яблок с олиго-фруктозой в течение 5 мин приводит примерно на 12% больше потери влажности и более высокой степени пропитки фруктоолигоса-харидов по сравнению с образцами, обезвоженными без применения давления [31]. Осмотическое обезвоживание ягод малины с использованием давления 1,33 МПа в течение 8 мин вызывало в 3-4 раза более высокую потерю воды, чем твердое усиление. Механическая стойкость, аромат и цвет ягод значительно улучшились путем пропитки раствором сахарозы [32].

Преимущество и недостатки осмотической дегидратации

В результате анализа осмотической дегидратации для плодов, фруктов и ягод можно выявить ряд преимуществ и недостатков (таблица 2) [2, 6]. Рассматривая плюсы и минусы осмотической дегидратации различными растворами можно с уверенностью сказать, что этот метод является предпочтительным по сравнению с другими методами так как в большей степени, сохраняются цвет, аромат, питательные компоненты и целостность пищевого продукта, что является важными показателями для переработанного плодово-ягодного сырья.

Преимущество и недостатки осмотической дегидратации Advantages and disadvantages of osmotic dehydration

Таблица 2. Table 2.

Осмотическая дегидратация, +/-Osmotic dehydration, +/- Показания | Indications

Преимущества Benefits Процесс удаления воды с низкой температурой и, следовательно, минимальная потеря цвета и вкуса. | The process of removing water with low temperature and, consequently, minimal loss of color and taste.

Сохранение аромата лучше, когда в качестве осмотического агента используют сахар или сахарный сироп. | Preservation of flavor is better when using sugar or sugar syrup as the osmotic agent.

Ферментативное и окислительное изменение предотвращается, так как нарезанные фрукты или плоды окружены сахарным сиропом, что позволяет сохранить хороший цвет с небольшим использованием или без использования оксида серы. | Enzymatic and oxidative change is prevented, since the sliced fruits or fruits are surrounded by sugar syrup, which allows to maintain a good color with little or no use of sulfur oxide.

Удаление кислоты и поглощение сахара фруктами, плодами и ягодами дают более сладкий вкус готовому продукту, чем традиционно высушенный продукт. | The removal of acid and the absorption of sugar by fruits, fruits and berries give a more sweet taste to the finished product than the traditionally dried product.

Частичное удаление воды, приводит к сокращению времени во время сушки или замораживания. | Partial removal of water, leads to a reduction in time during drying or freezing.

Потребление энергии меньше, поскольку процесс происходит при температуре окружающей среды. | Energy consumption is less, because the process takes place at ambient temperature.

Увеличивается плотность твердого тела благодаря поглощению твердых частиц и помогает получить более качественный продукт после сушки или замораживания. | The density of the solid increases due to the absorption of solid particles and helps to obtain a better product after drying or freezing.

Текстурное качество продукта намного лучше после восстановления. | The texture quality of the product is much better after restoration.

Срок хранения продукта значительно увеличивается. | The shelf life of the product is significantly increased.

Для процесса требуется простое оборудование. | The process requires simple equipment.

Недостатки disadvantages Из-за снижения уровня кислотности снижается характерный вкус в некоторых продуктах, но это возможно преодолеть, добавляя в раствор фруктовую кислоту. | Due to the decrease in acidity level, the characteristic taste in some products decreases, but it is possible to overcome it by adding fruit acid to the solution.

Сахарное покрытие для некоторых продуктах нежелательно т. к. после обработки возможно потребуется быстрое ополаскивание в воде. | Sugar coating for some products is undesirable because after processing it may be necessary to quickly rinse in water.

Обнаружено, что осмотическая дегидратация с другими комбинированными процессами, такими как вакуумная сушка, сушка на воздухе требует больше затрат. | It has been found that osmotic dehydration with other combined processes, such as vacuum drying, drying in air, requires more expenditure.

Процесс осмотической дегидратации требует длительного времени | In osmotic dehydrated products, water activity is higher.

Этот процесс требует длительного времени. | This process takes a long time

обработки и обработки продуктов для прекращения или значительного замедления порчи т. е. потери качества и питательной ценности вызвано или ускоренно развитием микроорганизмов. Сохранение обычно включает предотвращение роста бактерий, грибков и других микроорганизмов, а также замедление окисления жира, которое вызывает прогорклость. Он также включает в себя процессы, препятствующие естественному старению и обесцвечиванию, которые могут возникать во время приготовления пищи, такие как реакция ферментативного изменения в плодах, например, в яблоках после разрезания [2].

Следовательно, анализ аналитического обзора показал, что в России изучение и исследование осмотической дегидратации с помощью осмотических агентов изучен в малом объеме, а ведь данный метод позволяет подготовить фрукты, плоды и ягоды для дальнейшей обработки с одновременным переходом потери влаги и увеличить твердые вещества при погружении в осмотические растворы, в следствие чего приводит к частичной сушке при этом улучшая качество, органолептические, потребительские и пищевые свойства пищевого продукта.

Заключение

Осмотическая дегидратация успешно используется для снижения веса в материале до 50% и требует дополнительного замораживания или высушивания для увеличения срока годности. Этот процесс позволяет уменьшить энергосбережение и улучшить качества продукта. Осмотическую дегидратацию можно использовать как в больших масштабах для перерабатывающих пищевых промышленностей, так и для малых перерабатывающих предприятий, а также для домашней переработки плодово-ягодного сырья.

Выбор осмотического агента является основной задачей и может быть получен с использованием любого традиционного питательного углеводного подсластителя как моно-, так и диса-харида, такие как сахароза, инвертный сахар, декстроза, кукурузный сироп с высоким содержанием фруктозы, включая кукурузный сироп, мальтоза, фруктоза, кукурузная патока и фруктовые соки.

Сохранение продуктов питания для продления срока годности с обеспечением его безопасности и качества, является главной задачей пищевой промышленности. Ведь сохранение продуктов питания является процесс

REFERENCES

1 Yadav A.K., Singh S.V. Osmotic dehydration of fruits and vegetables: a review J Food Sci Technol 2014. 51 (9). рр. 1654-1673.

2 Ahmed I., Qazi I.M., Jamal S. Developments in osmotic dehydration technique for the preservation offruits and vegetables Innovative Food Science and Emerging Technologies 2016. vol. 34 рр. 29-43. DOI: 10.1016/j.ifset.2016.01.003.

3 Khan M.R. Osmotic dehydration technique for fruits preservation — A review Pakistan Journal of Food Sciences 2012. 22(2). рр. 71-85.

4 Phisut N. Factors affecting mass transfer during osmotic dehydration of fruits International Food Research Journal 2012. 19(1). рр. 7-18.

5 Tortoe C. A review of osmodehydration for food industry African Journal of Food Science 2010. 4(6). рр. 303-324.

6 Chavan U.D. Osmotic Dehydration Process for Preservation of Fruits and Vegetables Journal of Food Research 2012. vol. 1. no 2. рр. 202-209. DOI:10.5539/jfr.v1n2p202 http://dx.doi.org/10.5539/jfr.v1n2p202.

7 Matusek A., Czukor B., Meresz P. Comparison of sucrose and fructo-oligosaccharides as osmotic agents in apple Innovative Food Science & Emerging Technologies 2008. vol. 9. no 3, рр. 365-373.

8 Campos Camila Dalben Madeira et al. Effect of process variables on the osmotic dehydration of star-fruit slices Cienc. Tecnol. Aliment 2012. vol. 32. no 2. рр. 357-365.

9 Akbarian M., Ghasemkhani N., Moayedi F. Osmotic dehydration of fruits in food industrial: A review International Journal of Biosciences 2014. vol. 4, no 1. рр. 42-57.

10 Rahman M.S. Drying and food preservation. In R.M.S. (Ed.), Handbook of food preservation 2007. pp. 412 (2nd ed.). CRC Press.

11 Moreira R., Chenlo F., Torres M.D., Vazquez G. Effect of stirring in the osmotic dehydration of chestnut using glycerol solutions LWT-Food Science and Technology 2007. 40. рр. 1507-1514.

12 Ispir A., Togrul T.I. Osmotic dehydration of apricot: Kinetics and the effect of process parameters Chemical Engineering Research and Design 2009. 78. рр. 166-180.

13 Devic E., Guyoi S., Daudin J., Bonazzi C. Effect of temperature and cultivar on polyphenol retention and mass transfer during osmotic dehydration of apples Journal of Agricultural and Food Chemistry 2010. 58. рр. 606-614.

14 Bchir B., Besbes S., Attia H., Blecker C. Osmotic dehydration of pomegranate seeds (Punica Granatum L.): Effect of freezing pretreatment. 2012. 35(3). рр. 335-354. http://dx.doi.org/10.1111/j. 1745-4530.2010.00591.x.

15 Mundada M., Hathan S.B., Maske S. Mass transfer kinetics during osmotic dehydration of pomegranate arils Journal of Food Science 2011. 76. рр. 31-39.

16 Falade K.O., Igbeka J.C., Ayanwuyi F.A. Kinetics of mass transfer and colour changes during osmotic dehydration of watermelon Journal of Food Engineering 2007. 80. рр. 979-985.

17 Gribova N.A. Influence of sucrose solution on the quality of frozen fruit and berry cheese. Khraneniye i pere-rabotka sel’khozsyr’ya. [Storage and processing of agricultural raw materials] 2016, no 11, рр. 5-8. (in Russian).

18 Khin M.M., Zhou W., Yeo S.Y. Mass transfer in the osmotic dehydration of coated apple cubes by using malto-dextrin as the coating material and their textural properties J Food Eng 2007. 81. рр. 514-522.

19 Azoubell P.M., Francinaide O.S. Optimisation of osmotic dehydration of ‘Tommy Atkins’ mango fruit International Journal of Food Science and Technology 2008. 43. рр. 1276-1280.

20 Osorio C., Franco M.S., Castaño M.P., González-Miret M.P., Heredia F.J., Morales A.l. Colour and flavour changes during osmotic dehydration of fruits Innovative Food Science & Emerging Technologies 2007. 8. рр. 353-359.

21 Olatidoye O.P.l., Sobowale S.S., Akinlua O. Effect of osmodehydrofreezing on the quality attributes of frozen tomato Electronic Journal of Environmental, Agricultural and Food Chemistry 2010. 9(4) рр. 780-789.

22 Castelló M.L., Igual M., Fito P.J., Chiralt A. Influence of osmotic dehydration on texture, respiration andmi-crobial stability of apple slices (var. Granny Smith) Journal of Food Engineering 2009. 91(1). рр. 1-9.

23 Tiganitas A., Zeaki N., Gounadaki A.S., Drosinos E.H., Skandamis P.N. Study of the effect of lethal and sublethal pH and aw stresses on the inactivation or growth of Listeria monocytogenes and Salmonella typhimurium International Journal of Food Microbiology 2009. 134(1-2). рр. 104-112.

24 Zapata M., José E., Arias A., Johan M., Ciro G., Gelmy L. Optimization of osmotic dehydration of pineapple (Ananas comosus L.) using the response surface methodology Agronomía Colombiana 2011. 29 (2). рр. 249-256.

25 Klewicki R., Konopacka D., Uczciwek M., Irzyniec Z., Piasecka E., Bonazzi C. Sorption isotherms for osmo-convectively-dried and osmo-freeze-dried apple, sour cherry, and blackcurrant (ISAFRUIT Special Issue) The Journal of Horticultural Science and Biotechnology 2009. рр. 75-79.

26 Falade K.O., Igbeka J.C. Osmotic dehydration of tropical fruits and vegetables Food Reviews International 2007. 23(4). рр. 373-405.

27 Rupasinghe V., Handunkutti P., Joshi A.P.K., Pitts N.L. Non-fried apple food products and processes for their preparation. (US20100159082). 2010.

28 Santacruz-Vazquez C., Santacruz-Vazquez V., Jaramillo-Flores M.E., Chanona-Perez J., Welti Chanes J., et al. Application of osmotic dehydration processes to produce apple slices enriched with p-carotene Diying Technology 2008. 26(10). рр. 1265-1271.

29 Ferrari C.C., Aiballo J.R., Mascheroni R.H., Hubinger M.D. Modelling of mass transfer and texture evaluation during osmotic dehydration of melon under vacuum International Journal of Food Science and Technology 2011. 46(2). рр. 436-443.

30 Viana A.D., Corrêa J.L., Justus A. Optimisation of the pulsed vacuum osmotic dehydration of cladodes of fodder palm International Journal of Food Science and Technology 2013. 49(3). рр. 726-732.

31 Matusek A., Czukor B., Meresz P. Comparison of sucrose and fructooligosaccharides as osmotic agents in apple Innovative Food Science & Emerging Technologies 2008. 9. рр. 365-373.

32 Bórquez R.M., Canales E.R., Redon J.P. Osmotic dehydration of raspberries with vacuum pretreatment followed by microwave-vacuum drying Journal of Food Engineering 2010. 99(2). рр. 121-127.

33 Azoubel P.M. Optimization of osmotic dehydration of cashew apple (Anacardium Occidentale L.) in sugar solution // Food Sci Technol Int. 2007. 9(6) Р. 427-433.

34 Bolin H.R., Huxsoll C.C., Jackson R, Ng K.C. Effect of osmotic agents and concentration on fruit quality // J Food Sci. 2010. 48(1). Р. 202-205.

35 Rafiq Khan M. Osmotic dehydration technique for fruits preservation-A review // Pakistan Journal of Food Sciences. 2012. 22(2). Р 71-85.

36 Phisut N. Factors affecting mass transfer during osmotic dehydration of fruits // International Food Research Journal 2012. 19(1). Р. 7-18.

37 Shi J.J. Osmotic Dehydration of Foods // Food Drying Science and Technology: Microbiology, Chemistry, Applications, DEStech Publications, Inc. Pennsylvania, U.S.A. 2008. Р. 275-295.

38 Beristain C.I., Azuara E., Cortes R., Garcia H.S. Mass transfer during osmotic dehydration of pineapple rings // Intl J Food Sci Technol. 2008. 25(5). Р. 576-582.

39 Matuska M., Lenart A., Lazarides H.N. On the use of edible coatings to monitor osmotic dehydration kinetics for minimal solids uptake // Journal of Food Engineering. 2006. 72. Р. 85-91.

40 Bchir B., Besbes S., Attia H., Blecker C. Osmotic dehydration of pomegranate seeds: mass transfer kinetics and DSC characterization // Intl J Food Sci Technol. 2009. 44. Р. 2208-2217.

41 Sunjka PS, Raghavan GS. Assesment of pretreatment methods and osmotic dehydration for cranberries // Canadian Biosystems Engineering. 2008. 46. Р. 35-48.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ INFORMATION ABOUT AUTHORS

Наталья А. Грибова к.т.н., доцент, кафедра рестораного Natalya A. Gribova candidate of technical sciences, engi-бизнеса, Российский экономический университет имени neer, restaurant business department, Plekhanov Russian Eco-Г.В. Плеханова, Стремянный переулок, 36, г. Москва, nomic University, Stremyanniy lane, 36, Moscow, 117997, 117997, Россия, [email protected] Russia, [email protected]

Людмила Г. Елисеева д.т.н., профессор, кафедра товарове- Lyudmila G. Eliseeva doctor of technical sciences, profes-дения и товарной экспертизы, Российский экономический sor, commodity and commodity expertise department, Plekhanov университет имени Г.В. Плеханова, Стремянный переулок, 36, Russian Economic University, Stremyanniy lane, 36, Moscow, г. Москва, 117997, Россия), [email protected] 117997 Russia, [email protected]

КРИТЕРИЙ АВТОРСТВА CONTRIBUTION

Наталья А. Грибова написала рукопись, корректировала её до Natalya A. Gribova wrote the manuscript, correct it before filing подачи в редакцию и несёт ответственность за плагиат in editing and is responsible for plagiarism

Людмила Г. Елисеева консультация в ходе исследования Lyudmila G. Eliseeva consultation during the study

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ CONFLICT OF INTEREST

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. The authors declare no conflict of interest.

ПОСТУПИЛА 27.11.2017 RECEIVED 11.27.2017

ПРИНЯТА В ПЕЧАТЬ 11.12.2017 ACCEPTED 12.11.2017

Остеомаляция в практике эндокринолога: этиология, патогенез, дифференциальная диагностика с остеопорозом | Голоунина

ВВЕДЕНИЕ

Остеомаляция – системное заболевание скелета, характеризующееся нарушением минерализации или дефектной минерализацией вновь образованного костного матрикса у взрослых. В отличие от остеопороза, при остеомаляции на первый план выступает избыточное накопление неминерализованного остеоида, что способствует развитию вторичных деформаций и переломов костей [1].

Костные минералы образуются малыми несовершенными гидроксиапатитными кристаллами [Ca10(PO4)6(OH)2]. Для полноценной минерализации кости необходимы кальций, фосфат и щелочная фосфатаза (ЩФ). Этот процесс нарушается при дефиците витамина D, снижении всасывания кальция в кишечнике, гипофосфатемии, мутации в гене ALPL, кодирующем неспецифический тканевой изофермент ЩФ (tissue nonspecific alkaline phosphatase, TNSALP). Характерным признаком недостаточной минерализации при биопсии кости является повышенное содержание остеоида – новосинтезированного неминерализованного коллагена на поверхности кости. Наиболее выраженная недостаточная минерализация отмечается при гипофосфатазии, что связано с полным отсутствием TNSALP [2].

КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ОСТЕОМАЛЯЦИИ

Диагностика остеомаляции в большинстве случаев опирается на результаты клинических, лабораторных и рентгенологических исследований. В то же время сходство симптомов остеомаляции с другими метаболическими остеопатиями, а также с состояниями, не связанными с патологией скелета, нередко затрудняет диагностику (табл. 1).

Таблица 1. Дифференциальная диагностика остеомаляции

Симптомы

Заболевания

Снижение МПК

Остеопороз, ренальная остеодистрофия, первичный гиперпаратиреоз

Скелетные деформации

Остеохондродисплазии, гипофосфатазия

Боль в костях

Ревматическая полимиалгия, анкилозирующий спондилоартроз, гипофосфатазия

Мышечная слабость

Нервно-мышечные заболевания

Повышение ЩФ

Первичный гиперпаратиреоз, ренальная остеодистрофия, костные метастазы

Исходя из клинической картины заболевания, различают две формы остеомаляции – бессимптомную и манифестную. Бессимптомная форма характеризуется отсутствием очевидных признаков и жалоб, однако по результатам рентгеновских исследований выявляется снижение минеральной плотности кости (МПК) [3].

Одной из особенностей клинического проявления манифестной формы остеомаляции является выраженная мышечная слабость, обусловленная дефицитом кальция или фосфора, принимающих непосредственное участие в передаче нервно-мышечного импульса, а также выраженным дефицитом витамина D [4, 5]. Мышечная слабость, характерная для манифестной формы остеомаляции, определяет нарушение походки, которая описывается больными как «ватная». «Утиная походка» при ходьбе вследствие мышечной гипотонии и атрофии является серьезным клиническим признаком, позволяющим заподозрить диагноз.

Генерализованные диффузные боли в костях, являющиеся следствием растяжения надкостницы при деформации костей, особенно в поясничном отделе позвоночника, костях таза и нижних конечностях, – еще одна распространенная жалоба больных манифестной формой остеомаляции. При осмотре выявляется болезненность при пальпации в зонах проекций костей, искривления позвоночника, деформации грудной клетки и таза, особенно при длительном течении заболевания [3].

Этиологическая классификация остеомаляции у взрослых и основные лабораторные признаки дифференциальной диагностики сведены в табл. 2.

Таблица 2. Этиологическая классификация остеомаляции у взрослых и основные лабораторные признаки дифференциальной диагностики (адаптировано из [68])

 

Ca2+

Фосфор

25(ОН)D

1,25(OH)2D3

ПТГ

Другое

Гипокальциемия (причины, связанные с витамином D)

Дефицит витамина D

(недостаточная инсоляция, синдромы мальабсорбции, в том числе у пациентов после бариатрических операций, низкое содержание витамина D в пище)

$

$

$

#/N/$

#

 

Патология печени

$

$

$

$

N/#

 

Патология почек

$

#

N/$

$

##

 

Витамин D-резистентный рахит и остеомаляция тип I (нарушение 1α-гидроксилирования 25(ОН)D)

$

$

N

$$

#

 

Витамин D-резистентный рахит и остеомаляция тип II (резистентность органов-мишеней к 1,25(OH)2D3)

$

$

N

##

#

 

Гипофосфатемия, связанная с избыточной продукцией FGF23

Аутосомно-доминантная гипофосфатемия и остеомаляция (точковые миссенс-мутации в гене FGF23)

N/$

$

N

$

N/#

# FGF23

Аутосомно-рецессивный гипофосфатемический рахит и остеомаляция (мутации в гене DMP1)

N/$

$

N

$

N/#

# FGF23

Х-сцепленный доминантный гипофосфатемический рахит (мутации в гене PHEX)

N/$

$

N

$

N/#

# FGF23

Остеомаляция, индуцированная опухолью (секреция FGF23)

N/$

$

N

$

N/#

## FGF23

Синдром Мак-Кьюна–Олбрайта–Брайцева (полиостозная фиброзная дисплазия)

(мутации в гене GNAS)

N

$

N

$

N/#

## FGF23

Кожно-скелетный гипофосфатемический синдром, или эпидермальный невус-синдром (мутации в генах RAS-цепи: HRAS, KRAS, NRAS)

N/$

$

N

$

N/#

# FGF23

Гипофосфатемия (другие нарушения, приводящие к снижению фосфора)

Наследственный рецессивный гипофосфатемический рахит с гиперкальциурией (мутации в гене SLC34A3 (NaPi-IIc))

N

$

N

#

N

# Ca2+ и # фосфор в моче

Потеря фосфора с мочой

(Х-сцепленный рецессивный гипофосфатемический рахит с гиперкальциурией (болезнь Дента), синдром Фанкони, отравление тяжелыми металлами, отравление кадмием)

N

$

N

N

N

 

Избыточное потребление антацидов

N

$

N

#

N

 

Токсическая остеомаляция

Фториды

N

N

N

N

N

 

Алюминий (парентерально)

N

N

N

$

N

 

Иматинаб

$

$

$

N

#

 

Другие причины остеомаляции

Гипофосфатазия (взрослая форма)

N

N

N

N

N

$$ ЩФ

Метаболический ацидоз

N

N

$

N

N

 

ОСТЕОМАЛЯЦИЯ, СВЯЗАННАЯ С ДЕФИЦИТОМ ПОТРЕБЛЕНИЯ ВИТАМИНА D И КАЛЬЦИЯ

Наиболее часто остеомаляция развивается вследствие выраженного дефицита витамина D (<10 нг/мл) любой этиологии, а также нарушений его метаболизма, что приводит к снижению абсорбции кальция в кишечнике и сопровождается постоянной или транзиторной гипокальциемией [6]. На сегодняшний день недостаточная обеспеченность витамином D характерна для основной массы населения умеренных географических широт, а в некоторых странах дефицит витамина D признан пандемическим состоянием.

При нормальном функционировании почек гипокальциемия, обусловленная дефицитом витамина D, в отличие от гипопаратиреоза, сопровождается гипофосфатемией и увеличенным почечным клиренсом фосфатов. Подобное увеличение клиренса фосфатов – прямое следствие компенсаторного (вторичного) гиперпаратиреоза (ВГПТ) вследствие гипокальциемической стимуляции секреции паратиреоидного гормона (ПТГ), экспрессии гена ПТГ и пролиферации клеток околощитовидных желез (ОЩЖ) [7]. Определение содержания фосфатов и ПТГ в сыворотке крови необходимо для дифференциальной диагностики подобных нарушений с гипопаратиреозом. В свою очередь, ВГПТ приводит к усиленной мобилизации кальция из костей, повышенной реабсорбции кальция в почках и увеличению гидроксилирования 25(OH)D в 1,25(OH)2D3 1α-гидроксилазой (CYP27B1). Выраженный дефицит витамина D (<10 нг/мл), как правило, сопровождается низким уровнем 1,25(OH)2D3, тогда как на фоне умеренного дефицита витамина D (<20 нг/мл) стимуляция CYP27B1 под действием ПТГ может приводить к нормальному или даже повышенному уровню 1,25(OH)2D3 [8].

В подавляющем большинстве случаев остеомаляция, развивающаяся в связи с дефицитом витамина D, протекает без клинической симптоматики или проявляется проксимальной миопатией и болями в костях, однако данные симптомы могут быть неяркими и часто остаются незамеченными на начальной стадии заболевания.

Интересно, что случаи развития рахита у детей как вследствие дефицита витамина D при адекватном поступлении кальция, так и при дефиците кальция в условиях достаточной обеспеченности организма колекальциферолом [9] описаны во всех странах мира, тогда как у взрослых остеомаляция, связанная только с недостаточным потреблением кальция с продуктами питания, не отмечалась. Известно, что ограничение потребления кальция с пищей ведет к увеличению эффективности абсорбции кальция в кишечнике вследствие активации секреции ПТГ, который, в свою очередь, индуцирует синтез 1α-гидроксилазы (CYP27B1) в проксимальных извитых и прямых канальцах почек с последующим образованием 1,25(OH)2D3 [10]. Биологическое действие 1,25(OH)2D3 опосредовано через ядерные рецепторы витамина D (vitamin D receptor, VDR) [11]. Взаимодействие VDR с 1,25(OH)2D3 приводит к гиперфосфорилированию белка с последующими конформационными изменениями [12, 13] и активацией VDR на апикальной мембране клеток кишечника. В результате индуцируется экспрессия генов высокоселективных кальциевых каналов TRPV6 (transient receptor potential cation channel, subfamily V, member 6, TRPV6), генов кальций-связывающих белков (кальбидин D28k, кальбидин D9k) и других генов, участвующих в трансцеллюлярном транспорте кальция с его последующей абсорбцией в кишечнике [13–15]. Кроме того, ПТГ совместно с 1,25(OH)2D3 стимулируют реабсорбцию кальция в почечных канальцах, независимо от концентрации кальция в клубочковом фильтрате, уменьшают его экскрецию с мочой, тем самым увеличивая внеклеточную концентрацию. Этот эффект усиливается повышенным выделением кальций-связывающих белков – кальбидина D28k и кальбидина D9k, которое стимулируется 1,25(OH)2D3 [14]. Реабсорбция кальция также напрямую усиливается при любой тенденции к гипокальциемии, которую улавливают кальций-чувствительные рецепторы (CaSRs) с последующей модуляцией синтеза и секреции ПТГ. Влияние недостатка кальция в рационе сокращается примерно на 15% за счет высвобождения кальция из костной ткани в ответ на действие ПТГ и 1,25(OH)2D3. В результате описанных гомеостатических механизмов у людей с недостаточным потреблением кальция сохраняются околонормальные уровни общего и ионизированного кальция в сыворотке крови, однако присутствуют увеличенная абсорбция кальция в кишечнике, повышенная резорбция костной ткани и прогрессирующая остеопения, повышенная реабсорбция кальция и сниженная реабсорбция фосфатов в почечных канальцах, низкая экскреция кальция и повышенная экскреция фосфатов с мочой, а также высокая концентрация ПТГ в сыворотке крови.

ОСТЕОМАЛЯЦИЯ ВСЛЕДСТВИЕ НАРУШЕНИЯ ГИДРОКСИЛИРОВАНИЯ ВИТАМИНА D В ПЕЧЕНИ

С клинической точки зрения, выраженный дефицит витамина D, возникающий вследствие заболевания печени, встречается редко, поскольку степень деструкции печени, необходимая для нарушения гидроксилирования витамина D в положении C25 ферментом CYP2R1 с образованием 25(OH)D, несовместима с долгосрочным выживанием. Описаны семьи, у которых клинические и биохимические признаки указывали на наследственный дефект 25-гидроксилирования [16–18]. Однако генетический анализ неродственных между собой людей не позволил выявить мутации ни на кодирующем участке, ни в точках сплайсинга гена CYP2R1 [19]. Полученные данные в совокупности с наблюдениями, согласно которым особи мышей с генотипом Cyp2r1-/- имели снижение уровня 25(OH)D только на 50%, указывают на то, что CYP2R1 – не единственный фермент, способный осуществлять 25-гидроксилирование витамина D [20].

ПАТОГЕНЕЗ ОСТЕОМАЛЯЦИИ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ПОЧЕК

Различают две группы заболеваний почек, оказывающих существенное влияние на состояние костной ткани: хроническая болезнь почек (ХБП) и заболевания, связанные с преимущественным поражением канальцевых функций почек, – синдром де Тони–Дебре–Фанкони, ренальный тубулярный ацидоз.

Конечный этап активации витамина D – гидроксилирование 1α-гидроксилазой в 1,25(OH)2D3 в проксимальных извитых канальцах почек [21]. При хронической болезни почек нарушаются все звенья регуляции минерального обмена, проявляющиеся уже на ранних стадиях заболевания снижением синтеза кальцитриола, контролирующего активную реабсорбцию кальция в кишечнике, увеличением продукции фактора роста фибробластов 23 (fibroblast growth factor 23, FGF23), в норме предупреждающего развитие гиперфосфатемии, повышением экспрессии генов склеростина и Dickkopf-1 [22, 23].

Первичное повышение FGF23, снижающее активность 1α-гидроксилазы, является основной причиной дефицита кальцитриола, предопределяя в дальнейшем развитие костно-минеральных нарушений у больных ХБП [24]. При нормальном уровне фосфора в сыворотке крови сигналом для усиления продукции FGF23 выступает внутриклеточный фосфат, а также накопление фосфата в проксимальных канальцах почек. Поскольку падение синтеза α-Klotho, выявляемое даже у больных с ХБП I стадии, опережает повышение FGF23, имеются основания предполагать, что дефицит Klotho является первичным событием в развитии ренальной остеодистрофии [25, 26].

На ранних стадиях заболевания почек (ХБП II стадии), еще в отсутствие изменений показателей минерального обмена под влиянием провоспалительных цитокинов, трансформирующего фактора роста-β (transforming growth factor beta, TGF-β), токсинов (индоксил сульфата), усиливается экспрессия склеростина в остеоцитах и повышается его уровень в сыворотке крови, вызывая нарушения Wnt-сигнального пути, что тормозит созревание и дифференцировку остеобластов, но ингибирует продукцию ПТГ [27]. Одновременно развивается дефицит α-Klotho и усиливается секреция FGF23 остеоцитами и остеобластами, предупреждая гиперфосфатемию [24]. По мере прогрессирования ХБП преодолевается ингибирующее влияние FGF23 на секрецию ПТГ и повышается уровень Dickkopf-1 и SFRP1 (secreted-frizzled related protein 1) в сыворотке больных [28]. При этом продукция склеростина снижается, а Dickkopf-1 усугубляет нарушения Wnt-сигнального пути и минерализацию костной ткани, что в итоге индуцирует развитие ВГПТ [27].

Синдром де Тони–Дебре–Фанкони – генерализованная проксимальная тубулопатия, характеризующаяся неселективным дефектом систем транспорта и реабсорбции аминокислот, глюкозы, фосфатов, бикарбонатов, мочевой кислоты, цитратов, белков с низкой молекулярной массой [29]. При данном синдроме кальций, магний, натрий, калий и вода также экскретируются в большом количестве. Различают наследственные и приобретенные варианты данного заболевания.

Приобретенный синдром Фанкони возникает при отравлении солями тяжелых металлов (свинец, кадмий, ртуть), токсическом воздействии лекарственных средств, различных химикатов, соединений, приводящих к повреждению проксимальных канальцев почек и, как следствие, снижению реабсорбции фосфатов и повышенной потере фосфора с мочой [30]. Развивающаяся гипофосфатемия нарушает нормальную минерализацию костной ткани, а метаболический ацидоз приводит к снижению активности ЩФ. Кроме того, у больных синдромом Фанкони нередко наблюдается относительное снижение уровня витамина D в сыворотке крови [31].

Ренальный тубулярный ацидоз – еще одна группа канальцевых заболеваний почек, для которых характерно нарушение реабсорбции бикарбоната, секреции водородных ионов или сочетание обоих дефектов. Вследствие нарушения реабсорбции бикарбонатов в проксимальном канальце, бикарбонатурия развивается при нормальной концентрации бикарбонатов в плазме крови, что приводит к метаболическому ацидозу, несмотря на сохранные механизмы дистальной секреции ионов водорода. Как только концентрация плазменных бикарбонатов снижается ниже порогового значения, профильтрованные бикарбонаты начинают полностью реабсорбироваться [32]. Со стороны костной ткани также отмечаются изменения по типу рахита у детей и остеомаляции у взрослых.

ОСТЕОМАЛЯЦИЯ НА ФОНЕ ГИПОФОСФАТЕМИИ

Концентрация фосфатов в сыворотке крови регулируется натрий-зависимыми котранспортерами NaPi-IIa и NaPi-IIc, экспрессируемыми в проксимальных почечных канальцах. Снижение канальцевой реабсорбции, например, при патологическом повышении уровня ПТГ в сыворотке крови на фоне первичного или вторичного гиперпаратиреоза, при ПТГпП-связанной/зависимой гиперкальциемии на фоне злокачественных опухолей сопровождается развитием гипофосфатемии.

Другие причины нарушения реабсорбции фосфатов в почечных канальцах включают осмотический диурез, связанный с плохо контролируемым сахарным диабетом, алкоголизмом, гиперальдостеронизмом и воздействием ряда препаратов или токсинов, таких как ацетазоламид, ифосфамид, высокие дозы глюкокортикоидов, цисплатин и другие.

Несколько реже причиной остеомаляции у взрослых становится гиперпродукция FGF23. Анализ сцепления у подверженных заболеванию родственников позволил выявить мутацию гена FGF23 как основную причину аутосомно-доминантной гипофосфатемии и остеомаляции [33]. Точечные миссенс-мутации в гене FGF23 изменяют аминокислотную последовательность на участке расщепления FGF23 фуриноподобной протеазой (R176XXR179/S180), что сопровождается увеличением концентрации активной формы FGF23 в крови [34]. Повышенный уровень FGF23 также отмечают при аутосомно-рецессивной гипофосфатемии, обусловленной мутациями в генах, кодирующих матриксный белок дентина-1 (dentin matrix protein-1, DMP1) и FAM20C. DMP1 экспрессируется в остеоцитах и, предположительно, регулирует локальный синтез FGF23 [35]. FAM20C представляет собой секретируемую киназу, которая фосфорилирует FGF23 рядом с участком расщепления фурина. Подобное фосфорилирование необходимо для инактивации расщепления фуриноподобной протеазой [36]. Высокие уровни FGF23 в крови также наблюдаются при Х-сцепленном доминантном гипофосфатемическом рахите, обусловленном инактивирующими мутациями в гене PHEX [37,38], при остеомаляции, индуцированной опухолью, секретирующей FGF23, эпидермальном невус-синдроме [39], а также приблизительно у 50% пациентов с синдромом Мак-Кьюна–Олбрайта–Брайцева [40].

Почечный клиренс фосфатов может быть также нарушен вследствие инактивирующих мутаций в котранспортере NaPi-IIc, которые вызывают редкое заболевание, известное как наследственный рецессивный гипофосфатемический рахит с гиперкальциурией. При данном заболевании потеря фосфатов через почечные канальцы обуславливает сопутствующее повышение уровня 1,25(OH)2D3 в сыворотке крови, вызывая гиперкальциурию [41].

Полагают, что терапия с применением ингибиторов протеинтирозинкиназы – иматиниба и нилотиниба вызывает развитие гипофосфатемии вследствие ингибирования образования как остеобластов, так и остеокластов, снижения содержания кальция в сыворотке крови, стимулируя развитие ВГПТ [42–44].

ДРУГИЕ ПРИЧИНЫ ОСТЕОМАЛЯЦИИ

Крайне редко причиной остеомаляции становится гипофосфатазия – редкое наследственное метаболическое заболевание, обусловленное мутациями в гене ALPL [2]. При гипофосфатазии избыточное накопление неорганического пирофосфата, пиридоксаль-5’-фосфата и фосфоэтаноламина нарушает процессы минерализации костей и образования кристаллов гидроксиапатита [45]. Некоторые симптомы гипофосфатазии, выявляемые у взрослых, могут указывать на перенесенный в детстве рахит. Основной лабораторный признак гипофосфатазии, позволяющий провести дифференциальную диагностику с другими метаболическими заболеваниями скелета, – выраженное снижение ЩФ в крови [46].

Изредка мутации в обоих аллелях гена CYP27B1, кодирующего 1α-гидроксилазу, могут вызвать резистентность к витамину D. С биохимической точки зрения данное заболевание, называемое псевдо-витамин D-дефицитный рахит, характеризуется гипокальциемией и ВГПТ. Единственное метаболическое нарушение, позволяющее отличить заболевание от дефицита витамина D в рационе, – нормальный или повышенный уровень 25(OH)D в сыворотке крови, сопровождающийся низкой концентрацией 1,25(OH)2D3 [47]. Псевдо-витамин D-дефицитный рахит наследуется по аутосомно-рецессивному типу и проявляется в виде рахита, остеомаляции и судорог. Своевременное выявление данного заболевания, назначение активных метаболитов витамина D приводит к клинической ремиссии.

Мутации в гене VDR обуславливают развитие еще одного редкого наследственного заболевания с аутосомно-рецессивным типом наследования – витамин D-резистентного рахита и остеомаляции, характеризующегося резистентностью к биологическому действию 1,25(OH)2D3. Биохимическая картина данного заболевания совпадает с картиной дефицита витамина D и включает в себя гипокальциемию, гипофосфатемию и ВГПТ, однако, в отличие от дефицита витамина D, наблюдается повышенное содержание 1,25(OH)2D3 [48]. У большинства пациентов заболевание проявляется в раннем детстве в виде рахита, гипофосфатемии, судорог и алопеции, однако в литературе имеются сообщения о манифестации заболевания в позднем подростковом возрасте и даже у взрослых [49–51]. Вследствие резистентности органов-мишеней к активному метаболиту витамина D, единственной терапевтической возможностью является назначение активных метаболитов витамина D и кальция в супрафизиологических дозах или парентеральных инфузий препаратов кальция для коррекции остеомалятических поражений [52,53]. Исследования на мышах с заблокированным геном Vdr -/- показали, что поддержание нормального гомеостаза минеральных ионов предотвращает все осложнения заболевания, за исключением алопеции [54].

В ряде работ зарубежных исследователей представлены клинические случаи, описывающие больных с остеомаляцией на фоне хронической интоксикации фторидами [55–57]. Интересным является тот факт, что, несмотря на выраженность клинических проявлений, остеомаляция была выявлена лишь при детальном обследовании пациентов по поводу имеющихся костных нарушений, болевого синдрома в суставах и мышцах.

ИНСТРУМЕНТАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ОСТЕОМАЛЯЦИИ

Золотой стандарт дифференциальной диагностики костных нарушений при ХБП – костная биопсия с тетрациклиновыми метками. Важным аспектом лекарственной терапии при низкообменной патологии кости является ограничение назначения бисфосфонатов.

Гистоморфометрическое исследование является наиболее точным методом для установления диагноза остеомаляции, позволяющим оценить скорость костеобразования и кальцификации. Уровень аппозиции минералов, скорость остеогенеза, а также объем остеоида/костной ткани можно определить по результатам одной биопсии, но только после последовательной маркировки тетрациклином, необходимой для измерения расстояния между двумя фронтами минерализации [58, 59]. Интервалы маркировки несколько варьируют, однако, как правило, составляют 3 сут в начале (1–3-и сутки) и далее 3–21 сут с применением 250 мг тетрациклина 3–4 раза в сутки. Флюоресцирующий тетрациклин позволяет определить скорость обновления костной ткани, которая в норме составляет около 1 мкм/сут, в то время как для полной минерализации остеоида в нормальной кости требуется 10–21 сут [60]. Толщина слоя остеоида обычно не превышает 15 мкм, а поверхность кости, покрытая остеоидом, составляет менее 20% [61]. При остеомаляции расстояние между двумя тетрациклиновыми метками уменьшается, а также появляется неминерализованный матрикс в виде остеоидной полоски шириной >15 мкм и задержка минерализации >100 сут [62].

Рентгенологическими признаками заболевания являются увеличение прозрачности кости, размытость трабекулярного рисунка тел позвонков вследствие неадекватной минерализации остеоида, лишенного кальция, и рассасывания вторичных трабекул. При длительном течении заболевания происходит деформация замыкательных пластинок тел позвонков в виде их вдавления («рыбьи позвонки»), отмечаются кифосколиоз, деформированный треугольный таз с протрузией мыса крестца, деформации длинных трубчатых костей [63]. Наиболее характерный рентгенологический симптом остеомаляции – узкие поперечные линии шириной 2–5 мм, расположенные билатерально и симметрично и являющиеся переломами кортикального слоя кости вследствие перегрузки, вызванной стрессовым воздействием (зоны трансформации Лоозера, лоозеровские псевдопереломы) [64]. Подобные линии преимущественно располагаются в области шейки и медиальной части диафиза, около большого вертела бедренной кости, в лонном сочленении и седалищных буграх, реже – в лопатках, ключицах, ребрах, локтевых и плюсневых костях. При сцинтиграфии костей лоозеровские псевдопереломы проявляются в виде «горячих» пятен [65]. Множественные зоны трансформации Лоозера в литературе описывают как синдром Милкмена (Milkman syndrome).

Ввиду сходства рентгенологических признаков остеомаляцию необходимо дифференцировать от системного остеопороза. Остеопоротические изменения в трабекулярной части периферического скелета выражаются аналогичным рассасыванием трабекул, что рентгенологически проявляется разрежением их рисунка. Однако при остеомаляции, в отличие от остеопороза, кортикальные и трабекулярные структуры практически не дифференцируются, что отчетливо заметно в боковой проекции. Кроме того, стоит отметить, что рентгенография не служит методом диагностики остеопороза и используется лишь при подозрении на наличие компрессионных переломов тел позвонков и остеопоротических переломов других локализаций. Повышение прозрачности костной ткани на рентгеновских снимках – неспецифичный симптом, во многом зависящий от технических условий съемки и качества проявления рентгенограмм.

На сегодняшний день наиболее востребованным методом оценки МПК является двухэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия (dual-energy X-rays absorptiometry – DXA). Несмотря на все преимущества данного метода диагностики, DXA не позволяет оценить костный объем и структуру костной ткани, а также – провести дифференциальную диагностику и установить причину снижения костной массы, поскольку низкие значения МПК могут наблюдаться и при остеопорозе, и при остеомаляции. Таким образом, в случае впервые выявленного остеопороза по результатам DXA необходимо проведение дифференциальной диагностики и исключение других метаболических заболеваний скелета, при которых снижение МПК и/или низкотравматичные переломы являются основным проявлением [66].

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ОСТЕОМАЛЯЦИИ

Наряду с инструментальной диагностикой необходимо проведение ряда биохимических исследований, характеризующих состояние фосфорно-кальциевого обмена и костного метаболизма. Лабораторные изменения при остеомаляции включают повышение активности ЩФ, ПТГ, незначительное снижение кальция и фосфора в сыворотке крови, снижение 25(OH)D <15 нг/мл (табл. 3).

Таблица 3. Изменения лабораторных показателей при алиментарных причинах остеомаляции по данным ретроспективного исследования Basha B. [69], Bhambri R. [70]

Параметр

Значение

Частота встречаемости, %

Кальций

$

27–38

Фосфор

$

27–38

ПТГ

#

100

Щелочная фосфатаза

#

95–100

25(ОН)D, нг/мл

<15

100

Экскреция кальция с мочой

$

87

РАЦИОНАЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ К ЛЕЧЕНИЮ ПАЦИЕНТОВ С ОСТЕОМАЛЯЦИЕЙ

При анализе лабораторных данных в зависимости от полученных результатов можно предположить ту или иную форму остеомаляции (см. табл. 1). Однако основной задачей при лечении остеомаляции любой этиологии является устранение дефицита витамина D, гипокальциемии, гипофосфатемии, предотвращение прогрессирования деформаций костей и мышечной гипотонии.

Во всех случаях гипокальциемии необходимо назначение элементарного кальция. При выявлении дефицита витамина D или резистентности к нему метаболит витамина D подбирают в зависимости от заболевания. Например, при ХБП, витамин D-резистентном рахите назначают метаболиты, не требующие соответствующей модификации (кальцитриол или альфакальцидол в дозе от 0,25 до 1 мкг/сут, в ряде случаев до 3–4 мкг/сут). У пациентов с остеомаляцией, связанной с дефицитом потребления витамина D и кальция, оптимальным является применение лечебных доз колекальциферола [67].

Все пациенты, принимающие метаболиты витамина D и препараты кальция, должны быть осведомлены о потенциальных терапевтических осложнениях и находиться под динамическим наблюдением эндокринолога.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Остеомаляция, так же как и остеопороз, имеет большое социально-экономическое значение в связи с повышением риска возникновения низкотравматических переломов. К сожалению, большинство работ представляет собой описание отдельных или небольших серий случаев, что не дает возможности оценить истинную распространенность остеомаляции в популяции. Для исключения диагностической ошибки, в случае выраженного снижения костной массы по результатам DXA, перед назначением антиостеопоротической терапии рекомендуется проведение дополнительных лабораторных исследований и, в некоторых случаях, – гистоморфометрического исследования биоптата подвздошной кости с целью дифференциальной диагностики остеопороза и остеомаляции.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Поисково-аналитическая работа и подготовка статьи проведены на личные средства авторского коллектива.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов. Все авторы внесли значимый вклад в проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации.

1. Bilezikian JP, Bouillon R, Clemens T, et al, eds. Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. 1st ed. Wiley; 2018. doi: https://doi.org/10.1002/9781119266594

2. Whyte MP. Hypophosphatasia — aetiology, nosology, pathogenesis, diagnosis and treatment. Nat Rev Endocrinol. 2016;12(4):233-246. doi: https://doi.org/10.1038/nrendo.2016.14

3. Gifre L, Peris P, Monegal A, et al. Osteomalacia revisited : a report on 28 cases. Clin Rheumatol. 2011;30(5):639-645. doi: https://doi.org/10.1007/s10067-010-1587-z

4. Whyte MP, Thakker RV. Rickets and osteomalacia. Medicine. 2009;37(9):483-488. doi: https://doi.org/10.1016/j.mpmed.2009.06.004

5. Reginato AJ, Coquia JA. Musculoskeletal manifestations of osteomalacia and rickets. Best Pract Res Clin Rheumatol. 2003;17(6):1063-1080. doi: https://doi.org/10.1016/j.berh.2003.09.004

6. Christakos S, Li S, De La Cruz J, Bikle DD. New developments in our understanding of vitamin metabolism, action and treatment. Metabolism. 2019;98:112-120. doi: https://doi.org/10.1016/j.metabol.2019.06.010

7. Bove-Fenderson E, Mannstadt M. Hypocalcemic disorders. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2018;32(5):639-656. doi: https://doi.org/10.1016/j.beem.2018.05.006

8. Khundmiri SJ, Murray RD, Lederer E. PTH and Vitamin D. Compr Physiol. 2016;6(2):561-601. doi: https://doi.org/10.1002/cphy.c140071

9. Aggarwal V, Seth A, Aneja S, et al. Role of calcium deficiency in development of nutritional rickets in Indian children: a case control study. J Clin Endocrinol Metab. 2012;97(10):3461-3466. doi: https://doi.org/10.1210/jc.2011-3120

10. Adams JS, Hewison M. Extrarenal expression of the 25-hydroxyvitamin D-1-hydroxylase. Arch Biochem Biophys. 2012;523(1):95-102. doi: https://doi.org/10.1016/j.abb.2012.02.016

11. Margolis RN, Christakos S. The nuclear receptor superfamily of steroid hormones and vitamin D gene regulation. An update. Ann N Y Acad Sci. 2010;1192:208-214. doi: https://doi.org/10.1111/j.1749-6632.2009.05227.x

12. Morris HA. Vitamin D activities for health outcomes. Ann Lab Med. 2014;34(3):181-186. doi: https://doi.org/10.3343/alm.2014.34.3.181

13. Pike JW, Meyer MB. The vitamin D receptor: new paradigms for the regulation of gene expression by 1,25-dihydroxyvitamin D(3). Endocrinol Metab Clin North Am. 2010;39(2):255-269, table of contents. doi: https://doi.org/10.1016/j.ecl.2010.02.007

14. Li YC, Bolt MJ, Cao LP, Sitrin MD. Effects of vitamin D receptor inactivation on the expression of calbindins and calcium metabolism. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2001;281(3):E558-564. doi: https://doi.org/10.1152/ajpendo.2001.281.3.E558

15. Van Cromphaut SJ, Dewerchin M, Hoenderop JG, et al. Duodenal calcium absorption in vitamin D receptor-knockout mice: functional and molecular aspects. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98(23):13324-13329. doi: https://doi.org/10.1073/pnas.231474698

16. Molin A, Wiedemann A, Demers N, et al. Vitamin D-Dependent Rickets Type 1B (25-Hydroxylase Deficiency): A Rare Condition or a Misdiagnosed Condition? J Bone Miner Res. 2017;32(9):1893-1899. doi: https://doi.org/10.1002/jbmr.3181

17. Al Mutair AN, Nasrat GH, Russell DW. Mutation of the CYP2R1 vitamin D 25-hydroxylase in a Saudi Arabian family with severe vitamin D deficiency. J Clin Endocrinol Metab. 2012;97(10):E2022-2025. doi: https://doi.org/10.1210/jc.2012-1340

18. Casella SJ, Reiner BJ, Chen TC, et al. A possible genetic defect in 25-hydroxylation as a cause of rickets. J Pediatr. 1994;124(6):929-932. doi: https://doi.org/10.1016/s0022-3476(05)83184-1

19. Tosson H, Rose SR. Absence of mutation in coding regions of CYP2R1 gene in apparent autosomal dominant vitamin D 25-hydroxylase deficiency rickets. J Clin Endocrinol Metab. 2012;97(5):E796-801. doi: https://doi.org/10.1210/jc.2011-2716

20. Zhu JG, Ochalek JT, Kaufmann M, et al. CYP2R1 is a major, but not exclusive, contributor to 25-hydroxyvitamin D production in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(39):15650-15655. doi: https://doi.org/10.1073/pnas.1315006110

21. Jones G, Prosser DE, Kaufmann M. Chapter 5 — The Activating Enzymes of Vitamin D Metabolism (25- and 1α-Hydroxylases). In: Vitamin D. Volume 1: Biochemistry, Physiology and Diagnostics. 4th ed. Academic Press; 2018. p. 57-79. doi: https://doi.org/10.1016/b978-0-12-809965-0.00005-7

22. Thambiah S, Roplekar R, Manghat P, et al. Circulating sclerostin and Dickkopf-1 (DKK1) in predialysis chronic kidney disease (CKD): relationship with bone density and arterial stiffness. Calcif Tissue Int. 2012;90(6):473-480. doi: https://doi.org/10.1007/s00223-012-9595-4

23. Evenepoel P, D’Haese P, Brandenburg V. Sclerostin and DKK1: new players in renal bone and vascular disease. Kidney Int. 2015;88(2):235-240. doi: https://doi.org/10.1038/ki.2015.156

24. Рожинская Л.Я., Белая Ж.Е., Луценко А.С. Новые возможности лечения вторичного гиперпаратиреоза у пациентов с терминальной стадией хронической болезни почек, получающих заместительную почечную терапию гемодиализом. // Остеопороз и остеопатии. — 2017. — Т. 20. — №1. — С. 32-38. [Rozhinskaya LY, Belaya ZE, Lutsenko AS. Novel treatment options for secondary hyperparathyroidism in end-stage kidney disease patients on hemodialysis therapy. Osteoporosis and bone diseases. 2017;20(1):32-38. (In Russ.)] doi: https://doi.org/10.14341/osteo2017126-33

25. Barker SL, Pastor J, Carranza D, et al. The demonstration of alphaKlotho deficiency in human chronic kidney disease with a novel synthetic antibody. Nephrol Dial Transplant. 2015;30(2):223-233. doi: https://doi.org/10.1093/ndt/gfu291

26. Гребенникова Т.А., Белая Ж.Е., Цориев Т.Т., и др. Эндокринная функция костной ткани. // Остеопороз и остеопатии. — 2015. — Т. 18. — №1. — С. 28-37. [Grebennikova TA, Belaya ZE, Tsoriev TT, et al. The endocrine function of the bone tissue. Osteoporosis and bone diseases. 2015;18(1):28-37. (In Russ.)] doi: https://doi.org/10.14341/osteo2015128-37

27. Fang Y, Ginsberg C, Seifert M, et al. CKD-induced wingless/integration1 inhibitors and phosphorus cause the CKD-mineral and bone disorder. J Am Soc Nephrol. 2014;25(8):1760-1773. doi: https://doi.org/10.1681/ASN.2013080818

28. Silver J, Rodriguez M, Slatopolsky E. FGF23 and PTH—double agents at the heart of CKD. Nephrol Dial Transplant. 2012;27(5):1715-1720. doi: https://doi.org/10.1093/ndt/gfs050

29. Klootwijk ED, Reichold M, Unwin RJ, et al. Renal Fanconi syndrome: taking a proximal look at the nephron. Nephrol Dial Transplant. 2015;30(9):1456-1460. doi: https://doi.org/10.1093/ndt/gfu377

30. Hall AM, Bass P, Unwin RJ. Drug-induced renal Fanconi syndrome. QJM. 2014;107(4):261-269. doi: https://doi.org/10.1093/qjmed/hct258

31. Foreman JW. Fanconi Syndrome. Pediatr Clin North Am. 2019;66(1):159-167. doi: https://doi.org/10.1016/j.pcl.2018.09.002

32. Alexander RT, Bitzan M. Renal Tubular Acidosis. Pediatr Clin North Am. 2019;66(1):135-157. doi: https://doi.org/10.1016/j.pcl.2018.08.011

33. Bai XY, Miao D, Goltzman D, Karaplis AC. The autosomal dominant hypophosphatemic rickets R176Q mutation in fibroblast growth factor 23 resists proteolytic cleavage and enhances in vivo biological potency. J Biol Chem. 2003;278(11):9843-9849. doi: https://doi.org/10.1074/jbc.M210490200

34. Saleem S, Aslam HM, Anwar M, et al. Fahr’s syndrome: literature review of current evidence. Orphanet J Rare Dis. 2013;8:156. doi: https://doi.org/10.1186/1750-1172-8-156

35. Lorenz-Depiereux B, Bastepe M, Benet-Pages A, et al. DMP1 mutations in autosomal recessive hypophosphatemia implicate a bone matrix protein in the regulation of phosphate homeostasis. Nat Genet. 2006;38(11):1248-1250. doi: https://doi.org/10.1038/ng1868

36. Noonan ML, White KE. FGF23 Synthesis and Activity. Curr Mol Biol Rep. 2019;5(1):18-25. doi: https://doi.org/10.1007/s40610-019-0111-8

37. Sako S, Niida Y, Shima KR, et al. A novel PHEX mutation associated with vitamin D-resistant rickets. Hum Genome Var. 2019;6:9. doi: https://doi.org/10.1038/s41439-019-0040-3

38. Zhang S, Zhang Q, Cheng L, et al. [Analysis of PHEX gene mutations in three pedigrees affected with hypophosphatemic rickets]. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 2018;35(5):644-647. doi: https://doi.org/10.3760/cma.j.issn.1003-9406.2018.05.005

39. Avitan-Hersh E, Tatur S, Indelman M, et al. Postzygotic HRAS mutation causing both keratinocytic epidermal nevus and thymoma and associated with bone dysplasia and hypophosphatemia due to elevated FGF23. J Clin Endocrinol Metab. 2014;99(1):E132-136. doi: https://doi.org/10.1210/jc.2013-2813

40. Imel EA, Econs MJ. Fibrous dysplasia, phosphate wasting and fibroblast growth factor 23. Pediatr Endocrinol Rev. 2007;4 Suppl 4:434-439.

41. Hasani-Ranjbar S, Ejtahed HS, Amoli MM, et al. SLC34A3 Intronic Deletion in an Iranian Kindred with Hereditary Hypophosphatemic Rickets with Hypercalciuria. J Clin Res Pediatr Endocrinol. 2018;10(4):343-349. doi: https://doi.org/10.4274/jcrpe.0057

42. Berman E, Nicolaides M, Maki RG, et al. Altered bone and mineral metabolism in patients receiving imatinib mesylate. N Engl J Med. 2006;354(19):2006-2013. doi: https://doi.org/10.1056/NEJMoa051140

43. Vandyke K, Fitter S, Dewar AL, et al. Dysregulation of bone remodeling by imatinib mesylate. Blood. 2010;115(4):766-774. doi: https://doi.org/10.1182/blood-2009-08-237404

44. O’Sullivan S, Lin JM, Watson M, et al. The skeletal effects of the tyrosine kinase inhibitor nilotinib. Bone. 2011;49(2):281-289. doi: https://doi.org/10.1016/j.bone.2011.04.014

45. Addison WN, Azari F, Sorensen ES, et al. Pyrophosphate inhibits mineralization of osteoblast cultures by binding to mineral, up-regulating osteopontin, and inhibiting alkaline phosphatase activity. J Biol Chem. 2007;282(21):15872-15883. doi: https://doi.org/10.1074/jbc.M701116200

46. Родионова С.С., Захарова Е.Ю., Буклемишев Ю.В., и др. Гипофосфатазия у взрослых: клинические случаи и обзор литературы. // Остеопороз и остеопатии. — 2015. — T. 18. — №2. — С. 25-28. [Rodionova SS, Zakharova EY, Buklemishev YV, et al. Hypophosphatasia in adults: clinical cases and literature review. Osteoporosis and bone diseases. 2015;18(2):25-28. (In Russ.)] doi: https://doi.org/10.14341/osteo2015225-28.

47. Glorieux FH, Pettifor JM. Vitamin D/dietary calcium deficiency rickets and pseudo-vitamin D deficiency rickets. Bonekey Rep. 2014;3:524. doi: https://doi.org/10.1038/bonekey.2014.19

48. Supornsilchai V, Hiranras Y, Wacharasindhu S, et al. Two siblings with a novel nonsense mutation, p.R50X, in the vitamin D receptor gene. Endocrine. 2011;40(1):62-66. doi: https://doi.org/10.1007/s12020-011-9450-9

49. Malloy PJ, Tasic V, Taha D, et al. Vitamin D receptor mutations in patients with hereditary 1,25-dihydroxyvitamin D-resistant rickets. Mol Genet Metab. 2014;111(1):33-40. doi: https://doi.org/10.1016/j.ymgme.2013.10.014

50. Pang Q, Qi X, Jiang Y, et al. Clinical and genetic findings in a Chinese family with VDR-associated hereditary vitamin D-resistant rickets. Bone Res. 2016;4(1). doi: https://doi.org/10.1038/boneres.2016.18

51. Koren R. Vitamin D receptor defects: the story of hereditary resistance to vitamin D. Pediatr Endocrinol Rev. 2006;3 Suppl 3:470-475.

52. Nakabayashi M, Tsukahara Y, Iwasaki-Miyamoto Y, et al. Crystal Structures of Hereditary Vitamin D-Resistant Rickets-Associated Vitamin D Receptor Mutants R270L and W282R Bound to 1,25-Dihydroxyvitamin D3and Synthetic Ligands. J Med Chem. 2013;56(17):6745-6760. doi: https://doi.org/10.1021/jm400537h

53. Malloy PJ, Feldman D. Genetic Disorders and Defects in Vitamin D Action. Endocrinol Metab Clin North Am. 2010;39(2):333-346. doi: https://doi.org/10.1016/j.ecl.2010.02.004

54. Li YC, Amling M, Pirro AE, et al. Normalization of Mineral Ion Homeostasis by Dietary Means Prevents Hyperparathyroidism, Rickets, and Osteomalacia, But Not Alopecia in Vitamin D Receptor-Ablated Mice1. Endocrinology. 1998;139(10):4391-4396. doi: https://doi.org/10.1210/endo.139.10.6262

55. Izuora K, Twombly JG, Whitford GM, et al. Skeletal Fluorosis from Brewed Tea. J Clin Endocrinol Metab. 2011;96(8):2318-2324. doi: https://doi.org/10.1210/jc.2010-2891

56. Whyte MP, Totty WG, Lim VT, Whitford GM. Skeletal Fluorosis From Instant Tea. J Bone Miner Res. 2008;23(5):759-769. doi: https://doi.org/10.1359/jbmr.080101

57. Kurland ES, Schulman RC, Zerwekh JE, et al. Recovery From Skeletal Fluorosis (an Enigmatic, American Case). J Bone Miner Res. 2006;22(1):163-170. doi: https://doi.org/10.1359/jbmr.060912

58. Adams JE. Radiology of Rickets and Osteomalacia. In: Vitamin D. Volume 1: Biochemistry, Physiology and Diagnostics. 4th ed. Academic Press; 2018. p. 975-1006. doi: https://doi.org/10.1016/b978-0-12-809965-0.00054-9

59. Bhan A, Qiu S, Rao SD. Bone histomorphometry in the evaluation of osteomalacia. Bone Rep. 2018;8:125-134. doi: https://doi.org/10.1016/j.bonr.2018.03.005

60. Murshed M. Mechanism of Bone Mineralization. Cold Spring Harb Perspect Med. 2018;8(12):a031229. doi: https://doi.org/10.1101/cshperspect.a031229

61. Cazalbou S, Bertrand G, Drouet C. Tetracycline-Loaded Biomimetic Apatite: An Adsorption Study. J Phys Chem B. 2015;119(7):3014-3024. doi: https://doi.org/10.1021/jp5116756

62. Bitzan M, Goodyer PR. Hypophosphatemic Rickets. Pediatr Clin North Am. 2019;66(1):179-207. doi: https://doi.org/10.1016/j.pcl.2018.09.004

63. Fukumoto S, Ozono K, Michigami T, et al. Pathogenesis and diagnostic criteria for rickets and osteomalacia—proposal by an expert panel supported by the Ministry of Health, Labour and Welfare, Japan, the Japanese Society for Bone and Mineral Research, and the Japan Endocrine Society. J Bone Miner Metab. 2015;33(5):467-473. doi: https://doi.org/10.1007/s00774-015-0698-7

64. John TJ, van der Made T, Conradie M, Coetzee A. Osteomalacia and looser zones. QJM. 2019;112(6):455-455. doi: https://doi.org/10.1093/qjmed/hcy293

65. Kim S, Park CH, Chung Y-S. Hypophosphatemic Osteomalacia Demonstrated by Tc-99m MDP Bone Scan. Clin Nucl Med. 2000;25(5):337-340. doi: https://doi.org/10.1097/00003072-200005000-00003

66. Мельниченко Г.А., Белая Ж.Е., Рожинская Л.Я., и др. Федеральные клинические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике остеопороза. // Проблемы эндокринологии. — 2017. — T. 63. — №6. — С. 392-426. [Melnichenko GA, Belaya ZE, Rozhinskaya LY, et al. Russian federal clinical guidelines on the diagnostics, treatment, and prevention of osteoporosis. Problems of endocrinology. 2018;63(6):392-426. (In Russ.)] doi: https://doi.org/10.14341/probl2017636392-426

67. Пигарова Е.А., Рожинская Л.Я., Белая Ж.Е., и др. Клинические рекомендации Российской ассоциации эндокринологов по диагностике, лечению и профилактике дефицита витамина D у взрослых. // Проблемы эндокринологии. — 2016. — Т. 62. — №4. — С. 60-84. [Pigarova EA, Rozhinskaya LY, Belaya ZE, et al. Russian Association of Endocrinologists recommendations for diagnosis, treatment and prevention of vitamin D deficiency in adults. Problems of endocrinology. 2016;62(4):60-84. (In Russ.)] doi: https://doi.org/10.14341/probl201662460-84

68. Дедов И.И., Мельниченко Г.А. Эндокринология. Национальное Руководство. 2-е изд. — М.: ГЭОТАР-Медиа; 2018. [Dedov II, Mel’nichenko GA. Endokrinologiya. National guidelines. 2nd ed. Moscow; 2018. (In Russ.)]

69. Basha B, Rao DS, Han Z-H, Parfitt AM. Osteomalacia due to vitamin D depletion: a neglected consequence of intestinal malabsorption. Am J Med. 2000;108(4):296-300. doi: https://doi.org/10.1016/s0002-9343(99)00460-x

70. Bhambri R, Naik V, Malhotra N, et al. Changes in bone mineral density following treatment of osteomalacia. J Clin Densitom. 2006;9(1):120-127. doi: https://doi.org/10.1016/j.jocd.2005.11.001


Запор: что это, причины, лечение

Что такое запор?

Запор, по мнению врачей, бывает нескольких видов. Первый – острый. И он более знаком большинству из нас, он определяется простым временным периодом – если у вас нет стула в течение 2 или 3 дней. Второй тип гораздо серьезнее, и его принято называть «хроническим». Определить его также несложно: очищение кишечника обычно происходит реже трёх раз в неделю; при посещении туалета вам часто приходится изрядно натуживаться, и, наконец, после того, как вы все сделали, все равно может оставаться чувство незавершенности процесса – неполного очищения кишечника. Длительность этих симптомов при хроническом запоре обычно составляет не менее 3-х месяцев1.

Запор – проблема крайне деликатная, и говорить о ней в компании друзей как-то не принято. Иначе говоря, вы можете спросить совета по поводу лечения насморка или головной боли, но вот о сложностях со стулом вряд ли. Это приводит чаще всего к тому, что многие оставляют запор без особого внимания, считая его временной проблемой, которая «скоро пройдет». Как показывают современные исследования, запоры могут снизить качество жизни также сильно, как серьезные хронические сердечно-сосудистые заболевания или сахарный диабет1,2. При этом распространенность запоров высока – считается, что каждый пятый житель нашей страны страдает от этого нарушения работы кишечника3.

как определить запор у детей?

Работа детского кишечника отличается от работы кишечника взрослого человека. У детей иное расписание частоты стула, и важно учитывать ее, если вы вдруг решите поставить своему ребенку самостоятельный диагноз – запор. Посмотрите на данные из этой таблицы5, чтобы знать наверняка.

таблица ниже – можно показать в формате простой и понятной таблицы.

возраст число дефекаций в неделю число дефекаций в сутки
0 – 3 месяца грудное вскармливание 5-40 2,9
искусственное вскармливание 5-20 2,0
6 – 12 месяцев 5-28 1,8
1 – 3 года 4-21 1,4
4 года и старше 3-14 1

Каковы причины запоров?

Доказательством тому, что запор – это не рядовое явление, вроде того же насморка, служит огромное количество сведений, которые собирает врач, чтобы помочь пациенту с подобными проблемами. Отсюда и множество причин, симптомом которых являются вторичные запоры. Вот лишь часть из них:

  • Опухоль кишечника, которая может вызвать препятствие для прохождения кишечного содержимого.
  • Заболевания анальной области и прямой кишки, которые вызывают болезненность при стуле. Боль же приводит к тому, что человек просто боится посещать туалет часто.
  • Некоторые неврологические заболевания, например, болезнь Паркинсона.
  • Психические расстройства, например, депрессия или анорексия.
  • Прием ряда препаратов — антидепрессанты, опиоидные анальгетики1.

Отдельно можно выделить две причины запора, непосредственно связанных с состоянием кишечника

  • Антибиотикотерапия. Некоторые антибиотики могут угнетать нормальную флору желудочно-кишечного тракта, что негативно сказывается на процессах переваривания пищи. Полезные бактерии (лактобациллы, бифидобактерии, колибактерии и др.) необходимы для поддержания нормальной микрофлоры — её нарушение может приводить к задержке переваривания пищи. Они нужны для поддержания кислой среды внутри кишечника, которая сдерживает рост грибков и болезнетворных бактерий. Нарушения перистальтики и задержка каловых масс также нередко связана с изменением микрофлоры кишечника на фоне антибиотикотерапии. 1, 7
  • Дисбактериоз или дисбиоз. Это временное или постоянное нарушение баланса микрофлоры внутри кишечника. Его развитие может быть связано со многими заболеваниями, причем необязательно желудочно-кишечного тракта. Дисбактериоз может развиться при синдроме хронической усталости, стрессовом воздействии, депрессии; при длительно протекающих или хронических заболеваниях любого органа или системы; при нарушениях иммунитета; из-за снижения общих защитных сил организма. Неправильное питание, гиповитаминозы, прием некоторых лекарств также могут вызвать дисбиоз. 1, 8, 9

Однако, не стоит сразу искать у себя все эти пугающие признаки при запоре. Чаще всего мы страдаем от «пробки» в кишечнике по причинам более прозаическим. Из-за неправильного питания или временного нарушения функции кишечника, не связанного с другими болезнями1. А также из-за психологического дискомфорта при посещении туалета, например, в общественных местах или во время поездок и командировок. Такой запор принято называть функциональным (первичным).

У детей тоже есть «свои» причины для возникновения запоров. Например, введение в рацион новой пищи: особенно смесей для кормления и продуктов на основе коровьего или козьего молока. Также дети могут испытывать проблемы во время начала посещения яслей или детского сада – ребенку может быть неуютно в новой обстановке, где совершать деликатный процесс оказывается ужасно некомфортно. Все это заставляет ребёнка терпеть до дома, приводя к появлению привычного запора. Приучение к горшку также может привести к нарушению работы кишечника, поэтому оно должно проходить в спокойной форме, без конфликтов5.

Что назначает врач при запоре?

Врач может назначать разные исследования (рентгенографию брюшной полости, дефекографию, оценку скорости кишечного транзита) или направить на консультацию к другому специалисту для определения причины запора1. Если вам окажется непонятной связь между назначенными исследованиями и вашими жалобами, то не нужно стесняться — задайте вопрос своему доктору.

Как справиться с запором без лекарств?

Обычно методы нелекарственного лечения запоров, лучше всего работают с детьми. Часть из них связана с преодолением психологического барьера, который может возникнуть у ребенка в связи с посещением туалета. Ни в коем случае не стоит ребенка ругать или как-то намекать ему на то, что запор вам кажется вещью ужасной или неприемлемой. Главное, как говорил Карлсон – спокойствие. Прежде всего нужно объяснить ребёнку важность регулярного посещения туалета. Для этого можно начать предлагать ему садиться на горшок или унитаз сразу после еды. Важно, чтобы при этом у ребёнка был хороший упор для ног. Также важно обсудить с другими родителями и педагогами обустройство туалета в детском саду или яслях. Особенно, если другие дети там также сталкиваются со схожей проблемой5.

Другой действенный нелекарственный способ — изменение питания, и он может быть применим не только к детям, но и взрослым. Для начала уберите продукты, которые как большегрузы на трассе, тормозят движение по кишечнику: крепкий чай и кофе, протёртую пищу, манную и рисовую кашу, редис, кисели. Вместе с этим начните есть продукты, богатые пищевыми волокнами, они, как гоночные болиды, прибавят скорости прохождению в кишечнике. Движения пищи по кишечнику ускоряют также кислые фрукты, сладкие и солёные блюда, растительные жиры5. Причем питаться ими надо регулярно, по расписанию. Для взрослых среднее количество пищевых волокон в сутки составляет 20-25 грамм1. При этом важно помнить, что такие продукты нельзя есть «в сухомятку» — важна вода, 2 литра на 25 грамм пищевых волокон. Не будете пить – симптомы запора могут только усилятся.

Какие продукты богаты пищевыми волокнами

5,6?

Можно показать в виде простой таблички, где рядом с названиями продуктов их красивые картинки.

Продукт Количество пищевых волокон в 100 граммах продукта (в граммах)
Дыня 1-2
Ржаной хлеб 1-2
Морковь 1-1,9
Хлеб с отрубями 2-3
Клубника 4,5
Отруби пшеничные 8,2
Отруби пшеничные 14

Какие лекарства могут помочь при запоре?

Если профилактические меры не очень помогли, то при лечении функционального запора возможно применениеслабительных средств.. Например, осмотические слабительные – лекарства, содержащие полиэтиленгликоль или лактулозу. Принцип действия этих препаратов основан на том, что они становятся своего рода плотинами — удерживают жидкость в просвете кишечника. Это приводит к увеличению объема кала и ускорению его движения по кишечнику1.

Другая группа слабительных средств – стимулирующие. Среди этой группы препаратов выделяется препарат Гутталакс, действующим веществом которого является пикосульфат натрия. Гутталакс выпускается в виде капель, а также таблеток, что позволяет легко подбирать дозу для достижения оптимальной частоты стула. Если Гутталакс принимать перед сном, то физиологическое облегчение должно наступить на утро, когда вы привычно пойдете в туалет.

Также Гутталакс, по назначению врача, можно давать при запорах детям с первых дней жизни, а также применять беременным во втором-третьем триместре4. Все эти методы способны помочь решить деликатную проблему запора. Нужно быть готовыми к тому, что лечение потребует большого внимания к мелочам как со стороны врача, так и пациента и его близких. Зато потом, вы сможете с улыбкой процитировать строки, которые история приписывает Александру Пушкину: «Блажен, кто рано поутру имеет стул без принужденья, тому все яства по нутру и все доступны наслажденья».

Водные ресурсы и обеспечение продовольственной безопасности и питания

%PDF-1.5 % 2 0 obj > /Metadata 5 0 R /PageMode /UseOutlines /OpenAction 6 0 R /PageLayout /SinglePage /StructTreeRoot 7 0 R >> endobj 5 0 obj > stream 2015-07-09T16:13:29+02:002015-07-10T20:08:56+02:00Microsoft® Word 2010Microsoft® Word 2010application/pdf

  • Водные ресурсы и обеспечение продовольственной безопасности и питания
  • High Level Panel of Experts (HLPE)
  • endstream endobj 3 0 obj > stream x]ms~-tjkصHq7KdtTձEEΟOl]0flF~O&8D

    Осмотический стресс, скученность, предпочтительная гидратация и связывание: сравнение перспектив

    Proc Natl Acad Sci U S. A. 2000, 11 апреля; 97 (8): 3987–3992.

    Биофизика

    В. А. Парсегян

    * Лаборатория физической и структурной биологии, Национальный институт здоровья детей и развития человека, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд 20892-5626; и Департамент биологических наук, Университет Брока, Сент-Катаринс, Онтарио, L2S 3A1 Канада

    R.П. Рэнд

    * Лаборатория физической и структурной биологии, Национальный институт здоровья детей и развития человека, Национальные институты здоровья, Бетесда, Мэриленд 20892-5626; и Департамент биологических наук, Университет Брока, Сент-Катаринс, Онтарио, L2S 3A1 Канада

    DC Rau

    * Лаборатория физической и структурной биологии, Национальный институт здоровья детей и развития человека, Национальные институты здравоохранения , Bethesda, MD 20892-5626; и Департамент биологических наук, Университет Брока, Санкт-Петербург.Catharines, ON, L2S 3A1 Canada

    * Лаборатория физической и структурной биологии, Национальный институт здоровья детей и развития человека, Национальные институты здравоохранения, Бетезда, Мэриленд 20892-5626; и Департамент биологических наук, Университет Брока, Сент-Катаринс, Онтарио, L2S 3A1 Канада

    Кому запросы на перепечатку следует направлять по адресу: Building 12A, Room 2041, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20892- 5626. Электронная почта: [email protected]

    Передано Дональдом Л. Д. Каспаром, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида

    Получено 19 октября 1999 г .; Принято 13 января 2000 г.

    Copyright © 2000, Национальная академия наук

    Abstract

    В последнее время возникла большая путаница относительно относительных достоинств различных подходов, осмотического стресса, преимущественного взаимодействия и скопления, для описания косвенного воздействия растворенных веществ на макромолекулярные конформации и реакции.Чтобы усилить все интерпретации измерений и предотвратить дальнейшую ненужную концептуальную или лингвистическую путаницу, мы показываем здесь, как можно согласовать разные точки зрения. Наш подход основан на соотношении Гиббса-Дюгема, универсальном ограничении на количество способов, которыми можно изменить температуру, давление и химические потенциалы нескольких компонентов в любой термодинамически определенной системе. Из этого общего уравнения Гиббса-Дюгема можно увидеть эквивалентность различных точек зрения и даже показать точную идентичность более специализированных уравнений, используемых в различных подходах.

    Популярное и поучительное приложение осмотического стресса (1) было использовано для измерения изменений макромолекулярной гидратации для нескольких реакций. При переходе от полностью дезокси к полностью насыщенным кислородом формам гемоглобин загружает около 60 молекул воды (2). Переходя от закрытого к последовательному открытому состоянию, ионные каналы аламетицина поглощают 100 вод (3). Укусив глюкозу, гексокиназа вытесняет 320 молекул воды (4). Неспецифический ДНК-комплекс рестрикционной нуклеазы Eco RI секвестрирует примерно на 110 вод больше, чем специфический комплекс (5).Это воды, которые предпочтительно связаны с белком или макромолекулой или диссоциированы с ними, воды, отводимые или выделяемые в растворенные вещества в среде для купания. Такие количественные измерения воды как лиганда возможны, когда можно продемонстрировать, что работа по созданию различных макромолекулярных состояний изменяется пропорционально химическому потенциалу воды, а не химическим потенциалам агентов, используемых для изменения активности воды.

    В то же время растет осознание того, что молекулы в клетке стерически «теснят» друг друга в их совместно обитаемом водном пространстве (6) и что это стерическое взаимодействие может быть усилено за счет предпочтительной гидратации молекул (7).Мощные перспективы осмотического стресса, предпочтительной гидратации и скученности являются результатом общего происхождения теории растворов (8). В частности, теория растворов может быть специализирована для распознавания косвенного воздействия растворенных веществ на макромолекулы, которое происходит в дополнение к прямому действию определенных растворенных веществ через связывание с макромолекулами.

    Провидческие работы Асакуры и Осавы (9), а также ранние работы Танфорда (10) и Тимашева (7) побудили всех нас увидеть различные способы взаимодействия молекул друг с другом.В принципе (10) и на практике (11) растворенное вещество может иметь двоякий эффект. Та же самая молекула, которая напрямую связывается с белком, также может косвенно влиять на конформацию белка через изменения активности воды. Современные количественные исследования конкретных систем показали, что можно сознательно выбирать между различными точками зрения в зависимости от того, как макромолекулы реагируют на добавление растворенных веществ. На практике каждая из этих различных точек зрения может быть поучительной в зависимости от макромолекулярной системы, плана эксперимента и наблюдаемых свойств.

    И изображения скученности, и предпочтительной гидратации сосредоточены на свойствах растворенных веществ, которые исключены из макромолекул. Осмотический стресс подчеркивает роль воды, которая обязательно включается, если исключены растворенные вещества. В частности, составы краудинга используют размер и геометрию растворенных веществ или полимеров в растворе для расчета вклада отталкивания твердого ядра в свободную энергию макромолекулы непосредственно, например, с помощью теории масштабированных частиц. И предпочтительная гидратация, и осмотический стресс основаны на уравнении Гиббса-Дюгема.

    Эти разные взгляды на молекулярное действие дополняют друг друга, а не исключают друг друга. Недавно Тимашев (12) поставил под сомнение применение осмотического стресса к отдельным молекулам. Он утверждает, что подход к осмотическому стрессу «включает конфликт с законами термодинамики», но затем, в том же предложении, снимает осмотический стресс, говоря, что это «просто ограниченный случай предпочтительных взаимодействий, практикуемых в течение трех десятилетий». Его критика дополнительно осложняется признанием того, что подход осмотического стресса дает правильные числа:

    «Парадокс состоит в том, что, хотя теоретическая основа, представленная в осмотическом стрессе, неверна, эксперименты дали правильные числовые значения изменений предпочтительного гидратация, δ (∂ м 1 / ∂ м 2 ), поскольку на графиках использовались [уравнения, такие как уравнения.3 и 6 и их варианты] верны ».

    Нет никакого парадокса. Если бы Тимашев преобразовал свои символы в символы, используемые в анализе осмотического стресса, он бы успокоил себя, что осмотический стресс и анализ предпочтительной гидратации используют эквивалентные уравнения. Предполагаемый конфликт осмотического напряжения с термодинамическими законами возникает из-за особой интерпретации «инертности», наложенной Тимашевым, интерпретации, которая сама по себе противоречит явному термодинамическому использованию уравнения Гиббса-Дюгема.Его конкретное использование заставляет его думать, что энергетические последствия исключения растворенных веществ или сорастворителей были проигнорированы и что сохранение энергии нарушено. Это не тот случай.

    Вместо того, чтобы быть «ограниченным случаем предпочтительных взаимодействий» (12), анализ осмотического напряжения может фактически дать не только более четкую картину того, что происходит между макромолекулой и всеми компонентами раствора, но и прямой термодинамический показатель достигнутой гидратации. после измерения осмотического стресса с несколькими видами растворенных веществ.Хотя «термодинамика — прекрасная структура без содержания» (приписывается Аарону Качальски), эта структура является платформой, на которой мы можем организовать наши мысли о факторах, которые управляют стабильностью и функцией макромолекул.

    Термодинамические ограничения связывают различные точки зрения

    Уравнение Гиббса-Дюгема

    1

    определяет ограничения между изменениями температуры T , гидростатического давления p и химических потенциалов μ i компонента виды, входящие в состав препарата.Любое нарушение этого ограничения нарушает закон сохранения энергии. Взвешенный по энтропии S , объем v и количество молекул n i , по крайней мере одна из этих переменных ( T , p , μ i ) должна измениться, чтобы учесть любое изменение Другая.

    Макромолекула будет оказывать влияние на окружающие растворы, привлекая и накапливая одни виды, отталкивая другие. Традиционной отправной точкой для анализа взаимодействия компонентов раствора с макромолекулами является рассмотрение эксперимента по равновесному диализу.Мы рассматриваем для простоты комбинацию только трех видов: водный растворитель w , макромолекула M и малое растворенное вещество s . ( w , M и s иногда обозначаются 1, 2 и 3 соответственно, см. Таблицу). Раствор макромолекул, содержащий N w и N s молекул воды и растворенного вещества на макромолекулу, находится на одной стороне полупроницаемой мембраны. Этот раствор находится в равновесии со стандартным раствором, содержащим молекулы воды и растворенных веществ n w и n s .

    Таблица 1

    s / n w
    Тимашев (12) Парсегян, Рэнд и Рау (1)
    1 или w , вода w , вода
    макромолекула M , макромолекула
    3, сорастворитель с , растворенное вещество
    м x / м w , с

    8 9014 = 3

    x , B 3 N s
    w , B

    8

    1 62 90
    N w
    x — ( м x / м w ) v̄ w или B 3 — ( м 90 061 3 / м 1 ) B 1 N s N w ( n s / n w )
    [ср.уравнения 2 и 3b Тимашева (2)] (ср. уравнения 5a и 6a в настоящей статье)
    δ B 3 N s b N с a = Δ N с ab
    δ B 1 N w b N w a = Δ N w ab

    Затем для препаратов, хранящихся при постоянном давлении p и постоянной температуре T , ограничение Гиббса-Дюгема связывает изменение химического потенциала макромолекул или свободной энергии с изменениями в химическом потенциале растворенного вещества и воды,

    2

    Эталонный раствор имеет собственное ограничение Гиббса-Дюгема,

    3

    , которое требует, чтобы изменения химического потенциала воды и золя Они обязательно связаны:

    4

    Благодаря этой связи μ s ↔ μ w можно наблюдать прямое и косвенное влияние растворенных веществ и воды на макромолекулы.

    В искусстве диализной мембраны часто нет необходимости, если измерения проводятся на препаратах, достаточно разбавленных в макромолекуле, чтобы наблюдаемое поведение не учитывало вклады от взаимодействий между макромолекулами. Затем с полной строгостью мы можем думать о каждой макромолекуле как о растворенном растворе, в котором фактически нет других макромолекул. В этом пределе вода и растворенные вещества находятся в таком избытке, что наличие полупроницаемой мембраны излишне (рис.). Каждую макромолекулу можно рассматривать как находящуюся в равновесии с областями раствора, которые находятся достаточно далеко от макромолекулы, чтобы эти области имели те же свойства, что и эталонный раствор без макромолекул. В этих областях соотношение концентраций растворенного вещества / воды такое же, как и в сконструированном контрольном растворе. Можно представить себе, что каждая гидратированная молекула окружена собственной эффективной мембраной, различающей купающиеся виды (рис.).

    Разбавленные макромолекулы уравновешиваются основным раствором, который содержит соотношение растворенного вещества к воде n s / n w растворенного вещества.В области вокруг макромолекулы отношение растворенного вещества к воде, N s / N w , может отличаться от массы по разным причинам. Если это соотношение отличается между двумя конформациями макромолекулы, обозначенными здесь a и b , то влияние химического потенциала растворенного вещества или воды на равновесие можно описать уравнением. 5 . N s и N w должны рассматриваться как совокупный избыток или дефицит Гиббса (Приложение), т.е.е., как N s / N w отличается от n s / n w .

    Схематическое изображение того, как растворенные вещества могут вызывать осмотический стресс в различных системах в результате их исключения. Растворенное вещество можно стерически исключить из заполненных водой полостей, канавок, каналов или других подобных замкнутых объемов. Точки зрения скученности и предпочтительной гидратации, в частности, касаются исключения растворенных веществ с открытых макромолекулярных поверхностей.

    Можно сместить координаты, поместить отдельную макромолекулу в центр нашего мышления. Теперь мы запишем G s исходя из идеи свободной энергии Гиббса, а не мкс для той части химического потенциала, которая не зависит от концентрации макромолекул. При постоянной, разбавленной концентрации макромолекул изменение свободной энергии все еще описывается уравнением. 2, d μ M = — N w d μ w N s d μ s , но это соотношение экспериментально непрактично без ограничения уравнения .4 так что

    5a

    или

    5b

    N ew — избыточное (или дефицитное) количество вод в окрестностях макромолекулы; N es — избыточное (или недостаточное) количество растворенных веществ. Эти числа полностью аналогичны избытку (или дефициту) поверхности Гиббса, который описывает изменение свободной энергии поверхности при добавлении привлеченных или отталкиваемых растворенных веществ (см. Приложение).

    Изменение химического потенциала растворенного вещества d μ с равно d [ kT ln ( a s )], где a s — активность растворенного вещества, или d μ s = d [ kT ln (γ C s )], где γ — коэффициент активности растворенного вещества, а C s — его концентрация.Аналогично, изменение химического потенциала воды d μ w равно −V̄ w d Π, где V̄ w — молекулярный объем воды, а d Π — дополнительный вклад в осмотическое давление. раствора из добавленного растворенного вещества. Осмотическое давление — это, конечно, коллигативное свойство раствора; это зависит от активности всех компонентов. Однако в наших уравнениях и в эквивалентных уравнениях Тимашева активности всех компонентов, кроме одного растворенного вещества и воды, остаются постоянными.

    Должно быть очевидно, что если большая молекула не влияет на распределение растворенного вещества или воды, то добавленное растворенное вещество не влияет на свободную энергию макромолекулы. Только в той степени, в которой соотношение N s / N w растворенного вещества к воде вблизи макромолекулы отличается от их численного отношения n s / n w в При купании раствора произойдет изменение свободной энергии макромолекулы.Прямое связывание растворенных веществ с макромолекулой означает, что N s / N w > n s / n w ; или наоборот, если макромолекула притягивает воду сильнее, чем растворенное вещество, то N s / N w < n s / n w . Именно здесь Тимашев заявляет о конфликте с законами термодинамики из-за использования им слова инертный.Для нас инертное растворенное вещество — это вещество, которое не действует непосредственно на макромолекулу; нет ни реакции, ни связывания, которые вызывают изменение конформации макромолекулы. Один широкий класс таких инертных молекул — это естественные осмопротекторы, такие как бетаин и глицерин (13, 14). Это конкретное использование инертного является неотъемлемой частью термодинамического использования соотношения Гиббса-Дюгема. § В то же время особенности используемых агентов делают процедуру менее чисто термодинамической.

    Необходимость полупроницаемой мембраны определяется характером эксперимента. Для измерения N ew (или, что эквивалентно, N es ) для отдельных состояний a или b с помощью денситометрии, равновесного центрифугирования или рассеяния света (7, 15), например, требуется использование полупроницаемой мембраны, поскольку соотношения растворенных веществ и воды в эталонных растворах и растворах макромолекул определяются отдельно.Гидростатическое давление, возникающее из-за непроницаемой макромолекулы, будет влиять на распределение растворенного вещества и воды между двумя отсеками. Этот эффект незначителен в пределе разбавленного раствора. Для измерения разницы Δ N ew (или Δ N es ) между двумя состояниями макромолекул не требуется полупроницаемая мембрана, а требуется только метод определения концентрации или отношения вероятностей между двумя состояниями. Перераспределение растворенного вещества и воды вокруг макромолекулы будет влиять на объемную концентрацию растворенного вещества вдали от макромолекулы.Этот эффект также незначителен в пределе разбавленного раствора.

    Поучительные эксперименты — это те, которые включают переключение между аллостерическими состояниями, которые позволяют нам смотреть на различия в вероятностях состояний молекулы (как при открытии / закрытии ионных каналов) или на различия в концентрации (как при оксигенации гемоглобина), когда мы меняем раствор. условия. Если есть две формы макромолекулы a и b , отношение их концентраций (или их вероятностей) выражается в виде экспоненты в разности работы или свободной энергии Δ G ab = G b G a , необходимое для перехода отдельной молекулы между двумя формами, [ b ] / [ a ] = K eq = e (−Δ G ab / кТ ).

    Из уравнения. 5 , у нас

    6a

    или

    6b

    с Δ N ew ab = N ew b N ew a и Δ N es ab = N es b N es a . Наблюдаемое изменение отношения [ b ] / [ a ], следовательно, измеряет разницу в числах N ew или N es для двух состояний.

    Эти два уравнения и уравнения. 5a и 5b строго эквивалентны «фундаментальным уравнениям» 2, 3a и 3b Тимашева (12), потому что его m 3 / m 1 = n s / n w , δv̄ 3 = ( N s b N s a ) = Δ N s ab и δv̄ 1 = ( N w b N w a ) = Δ N w ab (полный перевод символов между двумя наборами уравнений см. В таблице).

    Ур. 6а эквивалентен стандартной изотерме адсорбции Гиббса, обычно используемой для расчета энергетических последствий прямого связывания растворенного вещества. В случаях, когда нет значительной разницы в количестве попутных вод, например, N w a = N w b , тогда, поскольку Δ N es ab = Δ N s ab , уравнение. 6b становится,

    7a

    или

    7b

    Для концентраций растворенных веществ, больших по сравнению с их константой диссоциации от макромолекулы, Δ N es ab является постоянным.Графики Δ G ab от Δμ s , как предписано уравнением. 7a, тогда линейны с наклонами, которые непосредственно дают Δ N s ab = N s b N s a . Применение уравнения. 7b дает нелинейные графики Δ G ab от Δμ w , которые не столь поучительны. В этих случаях различий в прямом связывании растворенного вещества с двумя состояниями макромолекулы имеет смысл использовать уравнение.7а, который связывает различия в химическом потенциале макромолекул с изменениями химического потенциала включенного растворенного вещества.

    В случаях, когда растворенные вещества исключаются нетто ( N s / N w < n s / n w ), коэффициент N ew в уравнении. 5b — это буквально чистое избыточное количество молекул воды, связанных или включенных в макромолекулу. Для макромолекулярной реакции или конформационного изменения из состояния a в состояние b , разностный член в уравнении.6b, Δ N ew ab , — это как раз разница между состояниями a и b в этом избыточном количестве вод, включенных в макромолекулу.

    На языке осмотического стресса уравнение. 6b теперь можно просто записать как изменение разности химических потенциалов между состояниями a и b , Δ G ab , в зависимости от изменения химического потенциала воды или осмотического давления,, и молекулярный объем воды, V ̄ w ,

    8

    В нескольких примерах, упомянутых Тимашевым (12), реакция открытия / закрытия мембранных каналов (3), оксигенация гемоглобина (2), связывание глюкозы гексокиназой (4), BZ-переходом поли (dG-m5dC) (16), оператором связывания репрессора гал-оперона (17), равновесием специфического / неспецифического связывания Eco RI (5), Δ G Было обнаружено, что ab в пределах экспериментальной точности изменяется линейно с осмотическим давлением Π в широком диапазоне концентраций растворенных веществ.Обычно эта линейность включает важный предел [растворенное вещество] → 0. Однако нельзя ожидать, что эта линейность распространится на сколь угодно высокие напряжения. При достаточно высоких концентрациях можно ожидать обмена исключенного растворенного вещества с предпочтительно включенной водой на открытых макромолекулярных поверхностях (18, 19). Кроме того, осмотическое напряжение в конечном итоге деформирует макромолекулу и искажает состояния a и b ; их отдельные N s и N w изменились бы с Π, чтобы дать искаженную оценку Δ N ew ab .

    Линейность Δ G ab относительно Π в этих нескольких случаях означает, что разница в избыточном количестве воды, включенной или связанной с двумя макромолекулярными состояниями, хорошо определена и остается постоянной по мере увеличения концентрации растворенного вещества. Константа Δ N ew ab не означает, что в примерах, перечисленных выше, нет связывания растворенных веществ с макромолекулами, а только то, что нет или очень мало различий в связывании растворенных веществ с двумя состояниями.Любая значительная разница в прямом связывании растворенного вещества с конкретными сайтами в двух макромолекулярных состояниях в дополнение к исключению будет иметь практический эффект, заключающийся в том, что кажущееся значение Δ N ew ab не будет постоянным и будет зависеть от активности растворенного вещества или , что то же самое, по осмотическому давлению. Двойная роль растворенного вещества наиболее четко прослеживается в эффекте хлорид-иона, который имеет как прямое связывание, так и механизмы действия, вызывающие осмотический стресс, на оксигенацию гемоглобина.Эти режимы были индивидуально измерены путем независимого изменения активности воды и активности хлорид-иона с использованием второго растворенного вещества (11).

    Эффекты и причины

    Перспектива осмотического стресса дает поучительно четкую картину причинных эффектов в растворах. Рис. Иллюстрирует две возможности, которые могут вызвать исключение растворенных веществ из макромолекулярного состояния. Макромолекула может иметь карманы или каналы для воды с отверстиями для основного раствора, которые просто слишком малы для проникновения растворенных веществ.Кроме того, растворенные вещества можно исключить с открытых макромолекулярных поверхностей. Перспективы скученности и предпочтительной гидратации были разработаны специально для учета этого последнего вида исключения. Измерения осмотического напряжения с несколькими растворенными веществами разного размера и химической природы, все эффекты которых линейно зависят от их вклада в химический потенциал воды, могут различать различные механизмы. Рис. Иллюстрирует наблюдаемые различия. На фиг. a показана зависимость свободной энергии связывания репрессора Escherichia coli gal с фрагментом ДНК, содержащим его операторную последовательность, от осмотического стресса для двух растворенных веществ, цвиттериона бетаинглицина и сравнительно неполярного триэтиленгликоля.Захоронение открытой поверхности сопровождает связывание свободного белка с ДНК. Фиг. b показывает зависимость изменения свободной энергии от осмотического давления для переноса рестрикционной нуклеазы Eco RI из комплекса с неспецифической ДНК к ее узнавающей последовательности, показанной для тех же двух растворенных веществ. В этой схеме избегается изменение площади поверхности, вызванное связыванием свободного белка. В обеих системах графики являются линейными, что указывает на то, что разница в количестве включенных вод между двумя сторонами реакции является постоянной во всем диапазоне исследуемых концентраций растворенных веществ.Существенная зависимость Δ N ew ab (уравнение 6a) от идентичности растворенного вещества для связывания свободного белка на фиг. a характерна для реакций, сопровождаемых значительными изменениями площади экспонированной поверхности. Соответствующая нечувствительность к идентичности растворенного вещества, наблюдаемая для переноса белка от одной последовательности ДНК к другой на рис. b , характерна для реакций, сопровождаемых доминирующими изменениями в количестве молекул воды, стерически изолированных в карманах или каналах.

    Наблюдаемая зависимость эффекта осмотического стресса от природы растворенного вещества дает представление об основе исключения. ( a ) Изменение энергии связывания репрессора E. coli с ДНК, содержащей его операторную последовательность, при увеличении концентрации растворенного вещества показано как функция осмотического давления растворенного вещества в осмоляльных единицах (данные взяты из ссылка 17). И бетаинглицин (●), и триэтиленгликоль (■), по-видимому, влияют на реакцию через разницу в N ew между свободным белком и ДНК в растворе и в комплексе.Однако разница в воде зависит от растворенного вещества; Δ N ew = 180 вод на комплекс для триэтиленгликоля и 100 для бетаинглицина. Это различие характерно для реакций, закапывающих открытую поверхность. ( b ) Зависимость от осмотического стресса разницы в энергии между специфическим связыванием рестрикционной нуклеазы Eco RI с фрагментом ДНК (ДНК2), который содержит его последовательность распознавания, и неспецифическим связыванием фермента с олигонуклеотидом ДНК ( ДНК1), который не несет последовательности распознавания.Это показано для тех же двух растворенных веществ, бетаинглицина (●) и триэтиленгликоля (■) (данные взяты из ссылки 8). В этом случае действие двух растворенных веществ идентично, в пределах экспериментальной ошибки, с Δ N ew = 110 вод. Этот результат характерен для реакций с изменением количества вод, которые изолированы в стерически недоступных карманах или полостях.

    Стерическое исключение из заполненных водой объемов

    Во многих работах по осмотическому стрессу использовались инертные растворенные вещества для определения изменений размера заполненных водой полостей, канавок, каналов или карманов, которые просто недоступны для растворенных веществ.Это исключение может быть обеспечено диализной мембраной, как это было сделано для реакции гелеобразования серповидного гемоглобина (20). Отличительной особенностью этих систем, например, реакцией открытия / закрытия нескольких каналов (3), оксигенацией гемоглобина (2) и равновесием специфического / неспецифического связывания Eco RI (5), является то, что Δ N ew ab незначительно или, в худшем случае, очень слабо изменяется в зависимости от типа растворенного вещества, используемого для изменения химического потенциала воды.Эти системы наиболее удобны для визуализации осмотического стресса. Опять же, может иметь место прямое связывание растворенного вещества и, скорее всего, исключение из открытых поверхностей, но разница в этом связывании или исключении из открытых поверхностей между двумя состояниями незначительна или отсутствует. Разница в количестве воды между двумя состояниями представляет собой реальный физический объем, который дает прямую информацию о структуре.

    Crowding

    Растворенные вещества часто не могут занимать область у стены или вблизи большой макромолекулярной поверхности.Эффект этого исключения заключается в создании сил истощения, которые сближают области, исключающие растворенные вещества (9). В раствор, содержащий растворенные вещества, выделяется некоторое количество молекул воды, Δ N ew . Эта классическая формула краудинга предполагает, что исключение растворенного вещества является чисто стерическим эффектом. Исключенные объемы рассчитываются на основе взаимодействия твердых сфер. Характерной чертой исключения краудинга является предсказуемая зависимость исключенного объема от размера растворенного вещества, но не от химической природы.Поскольку в рамках этой теоретической основы не рассматривается связывание растворенного вещества, лежащая в основе термодинамика в рамках подхода Гиббса-Дюгема может рассматриваться строго с точки зрения включенной воды. Действительно, в приближении первого порядка, часто используемом в анализе краудинга (например, ссылка 21), в котором пренебрегают взаимодействием растворенного вещества с растворенным веществом, обработка прозрачно дает изменение свободной энергии макромолекул, которое является произведением рассчитанного исключенного объема V̄ w Δ N ew , и приближение первого порядка к осмотическому давлению растворенного вещества (линейное по концентрации растворенного вещества в соответствии с законом Вант-Гоффа идеальных растворов).Расчетный исключенный объем может зависеть от осмотического давления, если включены члены более высокого порядка. Такие вычисления более высокого порядка трудны, потому что включение этих членов для самосогласованности также должно предсказывать осмотическое давление растворенных веществ. Чтобы избежать таких путаниц, в подходе осмотического стресса используются только измеренные осмотические давления.

    Уравнения состояния твердых частиц, которые используются для оценки скученности, могут дать геометрическое представление о космических войнах между молекулами. Для более крупных частиц в коллоидном масштабе силы истощения могут быть точно определены количественно (22).Однако для полимеров, действующих на белки, есть предположения, которые дают только качественную картину твердых сфер. Можно ли смоделировать случайный спиральный полимер как эффективную твердую сферу фиксированного диаметра? Измеренное исключение полиэтиленгликоля с разной молекулярной массой из белков, возможно (23, 24), согласуется с теснотой твердыми сферами (радиусы которых аппроксимируются радиусами вращения полимеров полиэтиленгликоля). Однако измерения с помощью молекулярного счетчика Коултера (25, 26) показывают, что полимеры полиэтиленгликоля разных размеров не всегда исключаются из четко определенных полостей, как того требует модель твердых сфер [e.g., рисунок 4 из Bezrukov et al. (25)]. Скорее, существует широкий диапазон частичного исключения в зависимости от размера молекулы.

    Предпочтительная гидратация

    Химическая природа растворенного вещества, а также его размер могут определять исключение из макромолекулярных поверхностей. Энергия взаимодействия фосфатной группы ДНК, например, с метиленовой группой триэтиленгликоля сильно отличается от энергии взаимодействия с водой. Тимашев (7, 27) сравнил этот механизм исключения растворенного вещества с открытых макромолекулярных поверхностей с увеличением поверхностного натяжения на границах раздела воздух-вода, вызванным полярными растворенными веществами и солями, которые также должны отражать исключение из этой конкретной границы раздела.Аналогия может быть дополнительно расширена путем построения разделяющей поверхности Гиббса для исключения растворенных веществ с открытых поверхностей белка, как это было проницательно сделано для влияния растворенных веществ на поверхностное натяжение воздух-вода (см. Приложение). Аракава и Тимашев (28) измерили зависимость свободных энергий исключения лактозы от площади поверхности белка. Наблюдаемое значение 1,5 кал / моль белка на моль лактозы на 2 Å площади поверхности переводится в эквивалентную разделяющую поверхность Гиббса, которая расположена на ∼ 4 Å от поверхности белка.Как будто на этом расстоянии (примерно один слой воды) не может быть обнаружена лактоза; снаружи будет основная концентрация лактозы. Энергия, необходимая для создания этой эквивалентной зоны, свободной от растворенного вещества, представляет собой работу осмотического давления растворенного вещества, умноженную на очищенный объем.

    Изученные нами макромолекулярные реакции, которые явно включают изменение площади экспонируемой поверхности, как, например, BZ-переход поли (dG-m 5 dC) (16) и связывание свободного E. coli gal. к его операторной последовательности (17), показал, что исключение каждого отдельного растворенного вещества может быть хорошо описано постоянным числом включенных вод, Δ N ew ab , (в диапазоне используемых концентраций растворенного вещества) , но эта разница в избыточном количестве воды между двумя состояниями очень чувствительна как к размеру, так и к химической природе растворенного вещества, исследующего реакцию.

    Перспективы

    Наш интерес к измерению количества воды, вытесняемой в макромолекулярных реакциях, основан на прямом измерении сил между макромолекулами. В этом случае макроскопические конденсированные массивы упорядоченных макромолекул уравновешиваются раствором полимера, который исключен из макромолекулярной фазы (обычно полиэтиленгликоль), и расстояния между макромолекулами измеряются (обычно с помощью рассеяния рентгеновских лучей) как функция осмотического давления полимера.Кривые зависимости термодинамической силы от расстояния были измерены для всех классов биологических макромолекул, липидных бислоев, ДНК, некоторых полисахаридов и белков. Поразительной особенностью этих сил является их сходство для всех очень разных систем, заряженных, нейтральных или полностью незаряженных. Мы интерпретировали эти измерения как указание на то, что макромолекулярные взаимодействия в последние 10–15 Å разделения преобладают за счет структурирования воды между поверхностями (29). Эти силы гидратации намного сильнее на близких расстояниях, чем ван-дер-ваальсовы или электростатические взаимодействия, которые обычно считаются важными.С этой точки зрения ключ к пониманию силы и специфичности, которые характеризуют большинство биологически важных реакций распознавания, находится в воде, которая высвобождается при сопряжении двух взаимодополняющих поверхностей.

    Независимо от того, какую точку зрения предпочитают думать о последствиях исключения растворенного вещества или полимера на реакции между макромолекулярными состояниями или конформациями, индуцированных энергий может быть достаточно, чтобы изменить конформации отдельных состояний. Можно не только измерить изменение исключения растворенного вещества, вызванное закрытием расщелины активного сайта гексокиназы связыванием глюкозы, но также, по-видимому, можно использовать сильное исключение растворенного вещества, чтобы закрыть щель даже в отсутствие глюкозы (4).Теперь можно начать отделить механику открытия и закрытия расщелины от энергетики связывания глюкозы. С помощью подхода осмотического стресса можно не только измерить разницу в секвестрированной воде между дезокси и лигандными конформациями димерного гемоглобина Scapharca , но также и высокие осмотические давления, по-видимому, способные изменить конформацию дезокси-формы на лигандную структуру даже в отсутствие лиганда (30). Не только может быть разница в изолированной воде между комплексами рестрикционной нуклеазы Eco RI, которые специфически и неспецифически связаны с ДНК, но и высокое осмотическое давление может удалить эту изолированную воду из неспецифических комплексов с определенными последовательностями ДНК, которые тесно связаны с ДНК. специфическая связывающая последовательность, но не другие (31).

    Это лишь несколько обнадеживающих примеров того, что можно узнать о макромолекулах, если внимательно посмотреть на их реакцию на активность воды.

    Благодарности

    Мы благодарим Чарльза Андерсона, Сергея Безрукова, Виктора Блумфилда, Дональда Каспара, Брэда Чейреса, Эрнеста Грюнвальда, Джека Корнблатта, Джеймса Ли, Сергея Лейкина, Марию МакГи, Аллана Минтона, Питера Николлса, Чарльза Спинка и Томаса Рекорда за полезное обсуждение или переписка.

    Подсчет количества молекул, адсорбированных на макромолекуле или отталкиваемых от нее

    Среди наиболее сложных концепций физической биохимии — как оценить количество молекул, связанных / притягиваемых или отталкиваемых от макромолекулы.Путаница особенно серьезна, когда происходит скопление или отталкивание небольших молекул около макромолекулы, а не чистое фиксированное связывание.

    Как и во многих термодинамических задачах, проблема была решена и концептуально решена Гиббсом. Рассмотрим изменение энергии поверхности, вызванное добавлением растворенного вещества в раствор, омывающий ее. Изотерма адсорбции Гиббса говорит, что свободная энергия поверхности будет уменьшаться с увеличением химического потенциала растворенного вещества прямо пропорционально плотности Γ растворенных веществ, связанных с поверхностью: dG = -Γ d μ растворенное вещество .Связанный означает избыточное количество молекул растворенного вещества, N es , на поверхности или около нее по сравнению с количеством растворенных веществ, которые могут находиться в том же объеме основного раствора.

    Точно так же отталкивание от поверхности, отрицательное значение N es , означает, что раствор вблизи макромолекул должен быть очищен от растворенных веществ, что требует затрат энергии. Повышенный химический потенциал растворенного вещества в ванне выталкивает растворенное вещество на поверхность и увеличивает стоимость очистки.

    Один из способов визуализировать энергетические затраты на исключение растворенного вещества — это признать, что существует изменение числовой плотности N ( x ) вблизи поверхности, отклонение от объемной плотности, N растворенное вещество (∞) . Если мы рассмотрим бесконечную плоскую поверхность, контактирующую с водным раствором растворенного вещества, связь между изменениями свободной энергии поверхности и изменениями химического потенциала растворенного вещества и воды происходит через это изменение концентрации растворенного вещества,

    A1

    Еще раз, соотношение Гиббса-Дюгема для видов, удаленных от поверхности, N растворенное вещество (∞) d μ растворенное вещество + N растворитель (∞) d μ растворитель = 0, делает это уравнение практическое.Интеграл по удаленной от поверхности области становится равным

    A2

    Свободная энергия поверхности изменяется только в той степени, в которой отношение растворенного вещества к растворителю отличается от соотношения в объеме.

    Макромолекула и притягиваемые / отталкиваемые компоненты ее раствора для купания действуют вместе одинаково. Для растворов, разбавленных макромолекулами, свойства этого раствора пропорциональны концентрации макромолекул. Можно интегрировать избыточное количество [ N i N i (∞)] всех частиц во всем пространстве вокруг каждой макромолекулы в духе изотермы адсорбции Гиббса.

    Двухзонные модели исключения одного растворенного вещества (32) и уравнения. A2 может быть соединен конструкцией разделяющей поверхности Гиббса, которая заменяет фактический профиль растворенного вещества N растворенного вещества ( x ) ступенчатой ​​функцией по концентрации от 0 до N растворенного вещества (∞). Расположение разделяющей поверхности, X Gibbs , фиксировано, чтобы обеспечить такой же поверхностный дефицит растворенного вещества, как и фактический градиент, или ∫ 0 [ N ( x ) — N растворенное вещество ( x )] dx = — N растворенное вещество (∞) X Gibbs .Таким образом, энергия, связанная с созданием этой прозрачной зоны, может рассматриваться как работа, необходимая для выталкивания полупроницаемой мембраны (проницаемой для воды, но не для растворенных веществ) с поверхности с размером x = 0 до x Gibbs . Это смещение вызывает осмотическую работу на единицу площади Π осмотический X Гиббс = кТ N растворенное вещество (∞) X Гиббс , в пределе Вант-Гоффа. Изящным применением этого рассуждения является теория Онзагера-Самараса о повышении поверхностного натяжения при добавлении сильного электролита в раствор (33).По мере того как соль отталкивается от поверхности, для ее создания требуется больше работы.

    Сноски

    § Инертное растворенное вещество в соответствии с определением, наложенным Тимашефф, — это вещество, которое взаимодействует с макромолекулой так же сильно (или так же слабо), как вода: N s / N w = n s / n w . В этом случае уравнения 5а и 5b, растворенное вещество, конечно, не может влиять на химический потенциал макромолекулы.

    Список литературы

    8. Грюнвальд Э. Термодинамика молекулярных частиц. Нью-Йорк: Уайли; 1997. [Google Scholar] 9. Asakura S, Oosawa F. J. Polym Sci. 1958; 33: 183–192. [Google Scholar] 16. Прейслер Р. С., Чен Х. Х., Коломбо М. К., Чоу Й., Шорт Б. Дж., Рау Д. К. Биохимия. 1995; 34: 14400–14407. [PubMed] [Google Scholar] 20. Прути М.С., Шехтер А.Н., Парсегян В.А., J. Mol Biol. 1985; 184: 517–528. [PubMed] [Google Scholar] 22. Динсмор А., Вонг Д. Т., Нельсон П., Йод А. Г. Phys Rev Lett. 1999. 80: 409–412.[Google Scholar] 23. Уиллс П. Р., Георгалис Й., Дейк Дж., Винзор Д. Biophys Chem. 1995; 57: 103–110. [PubMed] [Google Scholar] 25. Безруков С. М., Водяной И., Парсегян В. А. Природа (Лондон) 1994; 370: 279–281. [PubMed] [Google Scholar] 26. Безруков С. М., Водяной И., Брутян Р. А., Касьянович Дж. Макромолекулы. 1996; 29: 8517–8522. [Google Scholar] 29. Лейкин С., Парсегян В. А., Рау Д. К. Annu Rev Phys Chem. 1993; 44: 369–395. [PubMed] [Google Scholar] 32. Рекорд М. Т., младший, Чжан В., Андерсон С. Ф. Adv Protein Chem. 1998. 51: 281–353.[PubMed] [Google Scholar] 33. Ландау Л. Д., Лифшиц Е. М. Статистическая физика, Часть I. 3-е изд. Оксфорд: Пергамон; 1980., разделы 157 и 158. [Google Scholar]

    Осмотический стресс, скученность, предпочтительная гидратация и связывание: сравнение перспектив

    Proc Natl Acad Sci U S. A. 2000, 11 апреля; 97 (8): 3987–3992.

    Биофизика

    В. А. Парсегян

    * Лаборатория физической и структурной биологии, Национальный институт здоровья детей и развития человека, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд 20892-5626; и Департамент биологических наук, Университет Брока, Санкт-Петербург.Catharines, ON, L2S 3A1 Canada

    R. P. Rand

    * Лаборатория физической и структурной биологии, Национальный институт здоровья детей и развития человека, Национальные институты здравоохранения, Бетезда, Мэриленд 20892-5626; и Департамент биологических наук, Университет Брока, Сент-Катаринс, Онтарио, L2S 3A1 Канада

    DC Rau

    * Лаборатория физической и структурной биологии, Национальный институт здоровья детей и развития человека, Национальные институты здравоохранения , Bethesda, MD 20892-5626; и Департамент биологических наук, Университет Брока, Санкт-Петербург.Catharines, ON, L2S 3A1 Canada

    * Лаборатория физической и структурной биологии, Национальный институт здоровья детей и развития человека, Национальные институты здравоохранения, Бетезда, Мэриленд 20892-5626; и Департамент биологических наук, Университет Брока, Сент-Катаринс, Онтарио, L2S 3A1 Канада

    Кому запросы на перепечатку следует направлять по адресу: Building 12A, Room 2041, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20892- 5626. Электронная почта: [email protected]

    Передано Дональдом Л. Д. Каспаром, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида

    Получено 19 октября 1999 г .; Принято 13 января 2000 г.

    Copyright © 2000, Национальная академия наук

    Abstract

    В последнее время возникла большая путаница относительно относительных достоинств различных подходов, осмотического стресса, преимущественного взаимодействия и скопления, для описания косвенного воздействия растворенных веществ на макромолекулярные конформации и реакции.Чтобы усилить все интерпретации измерений и предотвратить дальнейшую ненужную концептуальную или лингвистическую путаницу, мы показываем здесь, как можно согласовать разные точки зрения. Наш подход основан на соотношении Гиббса-Дюгема, универсальном ограничении на количество способов, которыми можно изменить температуру, давление и химические потенциалы нескольких компонентов в любой термодинамически определенной системе. Из этого общего уравнения Гиббса-Дюгема можно увидеть эквивалентность различных точек зрения и даже показать точную идентичность более специализированных уравнений, используемых в различных подходах.

    Популярное и поучительное приложение осмотического стресса (1) было использовано для измерения изменений макромолекулярной гидратации для нескольких реакций. При переходе от полностью дезокси к полностью насыщенным кислородом формам гемоглобин загружает около 60 молекул воды (2). Переходя от закрытого к последовательному открытому состоянию, ионные каналы аламетицина поглощают 100 вод (3). Укусив глюкозу, гексокиназа вытесняет 320 молекул воды (4). Неспецифический ДНК-комплекс рестрикционной нуклеазы Eco RI секвестрирует примерно на 110 вод больше, чем специфический комплекс (5).Это воды, которые предпочтительно связаны с белком или макромолекулой или диссоциированы с ними, воды, отводимые или выделяемые в растворенные вещества в среде для купания. Такие количественные измерения воды как лиганда возможны, когда можно продемонстрировать, что работа по созданию различных макромолекулярных состояний изменяется пропорционально химическому потенциалу воды, а не химическим потенциалам агентов, используемых для изменения активности воды.

    В то же время растет осознание того, что молекулы в клетке стерически «теснят» друг друга в их совместно обитаемом водном пространстве (6) и что это стерическое взаимодействие может быть усилено за счет предпочтительной гидратации молекул (7).Мощные перспективы осмотического стресса, предпочтительной гидратации и скученности являются результатом общего происхождения теории растворов (8). В частности, теория растворов может быть специализирована для распознавания косвенного воздействия растворенных веществ на макромолекулы, которое происходит в дополнение к прямому действию определенных растворенных веществ через связывание с макромолекулами.

    Провидческие работы Асакуры и Осавы (9), а также ранние работы Танфорда (10) и Тимашева (7) побудили всех нас увидеть различные способы взаимодействия молекул друг с другом.В принципе (10) и на практике (11) растворенное вещество может иметь двоякий эффект. Та же самая молекула, которая напрямую связывается с белком, также может косвенно влиять на конформацию белка через изменения активности воды. Современные количественные исследования конкретных систем показали, что можно сознательно выбирать между различными точками зрения в зависимости от того, как макромолекулы реагируют на добавление растворенных веществ. На практике каждая из этих различных точек зрения может быть поучительной в зависимости от макромолекулярной системы, плана эксперимента и наблюдаемых свойств.

    И изображения скученности, и предпочтительной гидратации сосредоточены на свойствах растворенных веществ, которые исключены из макромолекул. Осмотический стресс подчеркивает роль воды, которая обязательно включается, если исключены растворенные вещества. В частности, составы краудинга используют размер и геометрию растворенных веществ или полимеров в растворе для расчета вклада отталкивания твердого ядра в свободную энергию макромолекулы непосредственно, например, с помощью теории масштабированных частиц. И предпочтительная гидратация, и осмотический стресс основаны на уравнении Гиббса-Дюгема.

    Эти разные взгляды на молекулярное действие дополняют друг друга, а не исключают друг друга. Недавно Тимашев (12) поставил под сомнение применение осмотического стресса к отдельным молекулам. Он утверждает, что подход к осмотическому стрессу «включает конфликт с законами термодинамики», но затем, в том же предложении, снимает осмотический стресс, говоря, что это «просто ограниченный случай предпочтительных взаимодействий, практикуемых в течение трех десятилетий». Его критика дополнительно осложняется признанием того, что подход осмотического стресса дает правильные числа:

    «Парадокс состоит в том, что, хотя теоретическая основа, представленная в осмотическом стрессе, неверна, эксперименты дали правильные числовые значения изменений предпочтительного гидратация, δ (∂ м 1 / ∂ м 2 ), поскольку на графиках использовались [уравнения, такие как уравнения.3 и 6 и их варианты] верны ».

    Нет никакого парадокса. Если бы Тимашев преобразовал свои символы в символы, используемые в анализе осмотического стресса, он бы успокоил себя, что осмотический стресс и анализ предпочтительной гидратации используют эквивалентные уравнения. Предполагаемый конфликт осмотического напряжения с термодинамическими законами возникает из-за особой интерпретации «инертности», наложенной Тимашевым, интерпретации, которая сама по себе противоречит явному термодинамическому использованию уравнения Гиббса-Дюгема.Его конкретное использование заставляет его думать, что энергетические последствия исключения растворенных веществ или сорастворителей были проигнорированы и что сохранение энергии нарушено. Это не тот случай.

    Вместо того, чтобы быть «ограниченным случаем предпочтительных взаимодействий» (12), анализ осмотического напряжения может фактически дать не только более четкую картину того, что происходит между макромолекулой и всеми компонентами раствора, но и прямой термодинамический показатель достигнутой гидратации. после измерения осмотического стресса с несколькими видами растворенных веществ.Хотя «термодинамика — прекрасная структура без содержания» (приписывается Аарону Качальски), эта структура является платформой, на которой мы можем организовать наши мысли о факторах, которые управляют стабильностью и функцией макромолекул.

    Термодинамические ограничения связывают различные точки зрения

    Уравнение Гиббса-Дюгема

    1

    определяет ограничения между изменениями температуры T , гидростатического давления p и химических потенциалов μ i компонента виды, входящие в состав препарата.Любое нарушение этого ограничения нарушает закон сохранения энергии. Взвешенный по энтропии S , объем v и количество молекул n i , по крайней мере одна из этих переменных ( T , p , μ i ) должна измениться, чтобы учесть любое изменение Другая.

    Макромолекула будет оказывать влияние на окружающие растворы, привлекая и накапливая одни виды, отталкивая другие. Традиционной отправной точкой для анализа взаимодействия компонентов раствора с макромолекулами является рассмотрение эксперимента по равновесному диализу.Мы рассматриваем для простоты комбинацию только трех видов: водный растворитель w , макромолекула M и малое растворенное вещество s . ( w , M и s иногда обозначаются 1, 2 и 3 соответственно, см. Таблицу). Раствор макромолекул, содержащий N w и N s молекул воды и растворенного вещества на макромолекулу, находится на одной стороне полупроницаемой мембраны. Этот раствор находится в равновесии со стандартным раствором, содержащим молекулы воды и растворенных веществ n w и n s .

    Таблица 1

    s / n w
    Тимашев (12) Парсегян, Рэнд и Рау (1)
    1 или w , вода w , вода
    макромолекула M , макромолекула
    3, сорастворитель с , растворенное вещество
    м x / м w , с

    8 9014 = 3

    x , B 3 N s
    w , B

    8

    1 62 90
    N w
    x — ( м x / м w ) v̄ w или B 3 — ( м 90 061 3 / м 1 ) B 1 N s N w ( n s / n w )
    [ср.уравнения 2 и 3b Тимашева (2)] (ср. уравнения 5a и 6a в настоящей статье)
    δ B 3 N s b N с a = Δ N с ab
    δ B 1 N w b N w a = Δ N w ab

    Затем для препаратов, хранящихся при постоянном давлении p и постоянной температуре T , ограничение Гиббса-Дюгема связывает изменение химического потенциала макромолекул или свободной энергии с изменениями в химическом потенциале растворенного вещества и воды,

    2

    Эталонный раствор имеет собственное ограничение Гиббса-Дюгема,

    3

    , которое требует, чтобы изменения химического потенциала воды и золя Они обязательно связаны:

    4

    Благодаря этой связи μ s ↔ μ w можно наблюдать прямое и косвенное влияние растворенных веществ и воды на макромолекулы.

    В искусстве диализной мембраны часто нет необходимости, если измерения проводятся на препаратах, достаточно разбавленных в макромолекуле, чтобы наблюдаемое поведение не учитывало вклады от взаимодействий между макромолекулами. Затем с полной строгостью мы можем думать о каждой макромолекуле как о растворенном растворе, в котором фактически нет других макромолекул. В этом пределе вода и растворенные вещества находятся в таком избытке, что наличие полупроницаемой мембраны излишне (рис.). Каждую макромолекулу можно рассматривать как находящуюся в равновесии с областями раствора, которые находятся достаточно далеко от макромолекулы, чтобы эти области имели те же свойства, что и эталонный раствор без макромолекул. В этих областях соотношение концентраций растворенного вещества / воды такое же, как и в сконструированном контрольном растворе. Можно представить себе, что каждая гидратированная молекула окружена собственной эффективной мембраной, различающей купающиеся виды (рис.).

    Разбавленные макромолекулы уравновешиваются основным раствором, который содержит соотношение растворенного вещества к воде n s / n w растворенного вещества.В области вокруг макромолекулы отношение растворенного вещества к воде, N s / N w , может отличаться от массы по разным причинам. Если это соотношение отличается между двумя конформациями макромолекулы, обозначенными здесь a и b , то влияние химического потенциала растворенного вещества или воды на равновесие можно описать уравнением. 5 . N s и N w должны рассматриваться как совокупный избыток или дефицит Гиббса (Приложение), т.е.е., как N s / N w отличается от n s / n w .

    Схематическое изображение того, как растворенные вещества могут вызывать осмотический стресс в различных системах в результате их исключения. Растворенное вещество можно стерически исключить из заполненных водой полостей, канавок, каналов или других подобных замкнутых объемов. Точки зрения скученности и предпочтительной гидратации, в частности, касаются исключения растворенных веществ с открытых макромолекулярных поверхностей.

    Можно сместить координаты, поместить отдельную макромолекулу в центр нашего мышления. Теперь мы запишем G s исходя из идеи свободной энергии Гиббса, а не мкс для той части химического потенциала, которая не зависит от концентрации макромолекул. При постоянной, разбавленной концентрации макромолекул изменение свободной энергии все еще описывается уравнением. 2, d μ M = — N w d μ w N s d μ s , но это соотношение экспериментально непрактично без ограничения уравнения .4 так что

    5a

    или

    5b

    N ew — избыточное (или дефицитное) количество вод в окрестностях макромолекулы; N es — избыточное (или недостаточное) количество растворенных веществ. Эти числа полностью аналогичны избытку (или дефициту) поверхности Гиббса, который описывает изменение свободной энергии поверхности при добавлении привлеченных или отталкиваемых растворенных веществ (см. Приложение).

    Изменение химического потенциала растворенного вещества d μ с равно d [ kT ln ( a s )], где a s — активность растворенного вещества, или d μ s = d [ kT ln (γ C s )], где γ — коэффициент активности растворенного вещества, а C s — его концентрация.Аналогично, изменение химического потенциала воды d μ w равно −V̄ w d Π, где V̄ w — молекулярный объем воды, а d Π — дополнительный вклад в осмотическое давление. раствора из добавленного растворенного вещества. Осмотическое давление — это, конечно, коллигативное свойство раствора; это зависит от активности всех компонентов. Однако в наших уравнениях и в эквивалентных уравнениях Тимашева активности всех компонентов, кроме одного растворенного вещества и воды, остаются постоянными.

    Должно быть очевидно, что если большая молекула не влияет на распределение растворенного вещества или воды, то добавленное растворенное вещество не влияет на свободную энергию макромолекулы. Только в той степени, в которой соотношение N s / N w растворенного вещества к воде вблизи макромолекулы отличается от их численного отношения n s / n w в При купании раствора произойдет изменение свободной энергии макромолекулы.Прямое связывание растворенных веществ с макромолекулой означает, что N s / N w > n s / n w ; или наоборот, если макромолекула притягивает воду сильнее, чем растворенное вещество, то N s / N w < n s / n w . Именно здесь Тимашев заявляет о конфликте с законами термодинамики из-за использования им слова инертный.Для нас инертное растворенное вещество — это вещество, которое не действует непосредственно на макромолекулу; нет ни реакции, ни связывания, которые вызывают изменение конформации макромолекулы. Один широкий класс таких инертных молекул — это естественные осмопротекторы, такие как бетаин и глицерин (13, 14). Это конкретное использование инертного является неотъемлемой частью термодинамического использования соотношения Гиббса-Дюгема. § В то же время особенности используемых агентов делают процедуру менее чисто термодинамической.

    Необходимость полупроницаемой мембраны определяется характером эксперимента. Для измерения N ew (или, что эквивалентно, N es ) для отдельных состояний a или b с помощью денситометрии, равновесного центрифугирования или рассеяния света (7, 15), например, требуется использование полупроницаемой мембраны, поскольку соотношения растворенных веществ и воды в эталонных растворах и растворах макромолекул определяются отдельно.Гидростатическое давление, возникающее из-за непроницаемой макромолекулы, будет влиять на распределение растворенного вещества и воды между двумя отсеками. Этот эффект незначителен в пределе разбавленного раствора. Для измерения разницы Δ N ew (или Δ N es ) между двумя состояниями макромолекул не требуется полупроницаемая мембрана, а требуется только метод определения концентрации или отношения вероятностей между двумя состояниями. Перераспределение растворенного вещества и воды вокруг макромолекулы будет влиять на объемную концентрацию растворенного вещества вдали от макромолекулы.Этот эффект также незначителен в пределе разбавленного раствора.

    Поучительные эксперименты — это те, которые включают переключение между аллостерическими состояниями, которые позволяют нам смотреть на различия в вероятностях состояний молекулы (как при открытии / закрытии ионных каналов) или на различия в концентрации (как при оксигенации гемоглобина), когда мы меняем раствор. условия. Если есть две формы макромолекулы a и b , отношение их концентраций (или их вероятностей) выражается в виде экспоненты в разности работы или свободной энергии Δ G ab = G b G a , необходимое для перехода отдельной молекулы между двумя формами, [ b ] / [ a ] = K eq = e (−Δ G ab / кТ ).

    Из уравнения. 5 , у нас

    6a

    или

    6b

    с Δ N ew ab = N ew b N ew a и Δ N es ab = N es b N es a . Наблюдаемое изменение отношения [ b ] / [ a ], следовательно, измеряет разницу в числах N ew или N es для двух состояний.

    Эти два уравнения и уравнения. 5a и 5b строго эквивалентны «фундаментальным уравнениям» 2, 3a и 3b Тимашева (12), потому что его m 3 / m 1 = n s / n w , δv̄ 3 = ( N s b N s a ) = Δ N s ab и δv̄ 1 = ( N w b N w a ) = Δ N w ab (полный перевод символов между двумя наборами уравнений см. В таблице).

    Ур. 6а эквивалентен стандартной изотерме адсорбции Гиббса, обычно используемой для расчета энергетических последствий прямого связывания растворенного вещества. В случаях, когда нет значительной разницы в количестве попутных вод, например, N w a = N w b , тогда, поскольку Δ N es ab = Δ N s ab , уравнение. 6b становится,

    7a

    или

    7b

    Для концентраций растворенных веществ, больших по сравнению с их константой диссоциации от макромолекулы, Δ N es ab является постоянным.Графики Δ G ab от Δμ s , как предписано уравнением. 7a, тогда линейны с наклонами, которые непосредственно дают Δ N s ab = N s b N s a . Применение уравнения. 7b дает нелинейные графики Δ G ab от Δμ w , которые не столь поучительны. В этих случаях различий в прямом связывании растворенного вещества с двумя состояниями макромолекулы имеет смысл использовать уравнение.7а, который связывает различия в химическом потенциале макромолекул с изменениями химического потенциала включенного растворенного вещества.

    В случаях, когда растворенные вещества исключаются нетто ( N s / N w < n s / n w ), коэффициент N ew в уравнении. 5b — это буквально чистое избыточное количество молекул воды, связанных или включенных в макромолекулу. Для макромолекулярной реакции или конформационного изменения из состояния a в состояние b , разностный член в уравнении.6b, Δ N ew ab , — это как раз разница между состояниями a и b в этом избыточном количестве вод, включенных в макромолекулу.

    На языке осмотического стресса уравнение. 6b теперь можно просто записать как изменение разности химических потенциалов между состояниями a и b , Δ G ab , в зависимости от изменения химического потенциала воды или осмотического давления,, и молекулярный объем воды, V ̄ w ,

    8

    В нескольких примерах, упомянутых Тимашевым (12), реакция открытия / закрытия мембранных каналов (3), оксигенация гемоглобина (2), связывание глюкозы гексокиназой (4), BZ-переходом поли (dG-m5dC) (16), оператором связывания репрессора гал-оперона (17), равновесием специфического / неспецифического связывания Eco RI (5), Δ G Было обнаружено, что ab в пределах экспериментальной точности изменяется линейно с осмотическим давлением Π в широком диапазоне концентраций растворенных веществ.Обычно эта линейность включает важный предел [растворенное вещество] → 0. Однако нельзя ожидать, что эта линейность распространится на сколь угодно высокие напряжения. При достаточно высоких концентрациях можно ожидать обмена исключенного растворенного вещества с предпочтительно включенной водой на открытых макромолекулярных поверхностях (18, 19). Кроме того, осмотическое напряжение в конечном итоге деформирует макромолекулу и искажает состояния a и b ; их отдельные N s и N w изменились бы с Π, чтобы дать искаженную оценку Δ N ew ab .

    Линейность Δ G ab относительно Π в этих нескольких случаях означает, что разница в избыточном количестве воды, включенной или связанной с двумя макромолекулярными состояниями, хорошо определена и остается постоянной по мере увеличения концентрации растворенного вещества. Константа Δ N ew ab не означает, что в примерах, перечисленных выше, нет связывания растворенных веществ с макромолекулами, а только то, что нет или очень мало различий в связывании растворенных веществ с двумя состояниями.Любая значительная разница в прямом связывании растворенного вещества с конкретными сайтами в двух макромолекулярных состояниях в дополнение к исключению будет иметь практический эффект, заключающийся в том, что кажущееся значение Δ N ew ab не будет постоянным и будет зависеть от активности растворенного вещества или , что то же самое, по осмотическому давлению. Двойная роль растворенного вещества наиболее четко прослеживается в эффекте хлорид-иона, который имеет как прямое связывание, так и механизмы действия, вызывающие осмотический стресс, на оксигенацию гемоглобина.Эти режимы были индивидуально измерены путем независимого изменения активности воды и активности хлорид-иона с использованием второго растворенного вещества (11).

    Эффекты и причины

    Перспектива осмотического стресса дает поучительно четкую картину причинных эффектов в растворах. Рис. Иллюстрирует две возможности, которые могут вызвать исключение растворенных веществ из макромолекулярного состояния. Макромолекула может иметь карманы или каналы для воды с отверстиями для основного раствора, которые просто слишком малы для проникновения растворенных веществ.Кроме того, растворенные вещества можно исключить с открытых макромолекулярных поверхностей. Перспективы скученности и предпочтительной гидратации были разработаны специально для учета этого последнего вида исключения. Измерения осмотического напряжения с несколькими растворенными веществами разного размера и химической природы, все эффекты которых линейно зависят от их вклада в химический потенциал воды, могут различать различные механизмы. Рис. Иллюстрирует наблюдаемые различия. На фиг. a показана зависимость свободной энергии связывания репрессора Escherichia coli gal с фрагментом ДНК, содержащим его операторную последовательность, от осмотического стресса для двух растворенных веществ, цвиттериона бетаинглицина и сравнительно неполярного триэтиленгликоля.Захоронение открытой поверхности сопровождает связывание свободного белка с ДНК. Фиг. b показывает зависимость изменения свободной энергии от осмотического давления для переноса рестрикционной нуклеазы Eco RI из комплекса с неспецифической ДНК к ее узнавающей последовательности, показанной для тех же двух растворенных веществ. В этой схеме избегается изменение площади поверхности, вызванное связыванием свободного белка. В обеих системах графики являются линейными, что указывает на то, что разница в количестве включенных вод между двумя сторонами реакции является постоянной во всем диапазоне исследуемых концентраций растворенных веществ.Существенная зависимость Δ N ew ab (уравнение 6a) от идентичности растворенного вещества для связывания свободного белка на фиг. a характерна для реакций, сопровождаемых значительными изменениями площади экспонированной поверхности. Соответствующая нечувствительность к идентичности растворенного вещества, наблюдаемая для переноса белка от одной последовательности ДНК к другой на рис. b , характерна для реакций, сопровождаемых доминирующими изменениями в количестве молекул воды, стерически изолированных в карманах или каналах.

    Наблюдаемая зависимость эффекта осмотического стресса от природы растворенного вещества дает представление об основе исключения. ( a ) Изменение энергии связывания репрессора E. coli с ДНК, содержащей его операторную последовательность, при увеличении концентрации растворенного вещества показано как функция осмотического давления растворенного вещества в осмоляльных единицах (данные взяты из ссылка 17). И бетаинглицин (●), и триэтиленгликоль (■), по-видимому, влияют на реакцию через разницу в N ew между свободным белком и ДНК в растворе и в комплексе.Однако разница в воде зависит от растворенного вещества; Δ N ew = 180 вод на комплекс для триэтиленгликоля и 100 для бетаинглицина. Это различие характерно для реакций, закапывающих открытую поверхность. ( b ) Зависимость от осмотического стресса разницы в энергии между специфическим связыванием рестрикционной нуклеазы Eco RI с фрагментом ДНК (ДНК2), который содержит его последовательность распознавания, и неспецифическим связыванием фермента с олигонуклеотидом ДНК ( ДНК1), который не несет последовательности распознавания.Это показано для тех же двух растворенных веществ, бетаинглицина (●) и триэтиленгликоля (■) (данные взяты из ссылки 8). В этом случае действие двух растворенных веществ идентично, в пределах экспериментальной ошибки, с Δ N ew = 110 вод. Этот результат характерен для реакций с изменением количества вод, которые изолированы в стерически недоступных карманах или полостях.

    Стерическое исключение из заполненных водой объемов

    Во многих работах по осмотическому стрессу использовались инертные растворенные вещества для определения изменений размера заполненных водой полостей, канавок, каналов или карманов, которые просто недоступны для растворенных веществ.Это исключение может быть обеспечено диализной мембраной, как это было сделано для реакции гелеобразования серповидного гемоглобина (20). Отличительной особенностью этих систем, например, реакцией открытия / закрытия нескольких каналов (3), оксигенацией гемоглобина (2) и равновесием специфического / неспецифического связывания Eco RI (5), является то, что Δ N ew ab незначительно или, в худшем случае, очень слабо изменяется в зависимости от типа растворенного вещества, используемого для изменения химического потенциала воды.Эти системы наиболее удобны для визуализации осмотического стресса. Опять же, может иметь место прямое связывание растворенного вещества и, скорее всего, исключение из открытых поверхностей, но разница в этом связывании или исключении из открытых поверхностей между двумя состояниями незначительна или отсутствует. Разница в количестве воды между двумя состояниями представляет собой реальный физический объем, который дает прямую информацию о структуре.

    Crowding

    Растворенные вещества часто не могут занимать область у стены или вблизи большой макромолекулярной поверхности.Эффект этого исключения заключается в создании сил истощения, которые сближают области, исключающие растворенные вещества (9). В раствор, содержащий растворенные вещества, выделяется некоторое количество молекул воды, Δ N ew . Эта классическая формула краудинга предполагает, что исключение растворенного вещества является чисто стерическим эффектом. Исключенные объемы рассчитываются на основе взаимодействия твердых сфер. Характерной чертой исключения краудинга является предсказуемая зависимость исключенного объема от размера растворенного вещества, но не от химической природы.Поскольку в рамках этой теоретической основы не рассматривается связывание растворенного вещества, лежащая в основе термодинамика в рамках подхода Гиббса-Дюгема может рассматриваться строго с точки зрения включенной воды. Действительно, в приближении первого порядка, часто используемом в анализе краудинга (например, ссылка 21), в котором пренебрегают взаимодействием растворенного вещества с растворенным веществом, обработка прозрачно дает изменение свободной энергии макромолекул, которое является произведением рассчитанного исключенного объема V̄ w Δ N ew , и приближение первого порядка к осмотическому давлению растворенного вещества (линейное по концентрации растворенного вещества в соответствии с законом Вант-Гоффа идеальных растворов).Расчетный исключенный объем может зависеть от осмотического давления, если включены члены более высокого порядка. Такие вычисления более высокого порядка трудны, потому что включение этих членов для самосогласованности также должно предсказывать осмотическое давление растворенных веществ. Чтобы избежать таких путаниц, в подходе осмотического стресса используются только измеренные осмотические давления.

    Уравнения состояния твердых частиц, которые используются для оценки скученности, могут дать геометрическое представление о космических войнах между молекулами. Для более крупных частиц в коллоидном масштабе силы истощения могут быть точно определены количественно (22).Однако для полимеров, действующих на белки, есть предположения, которые дают только качественную картину твердых сфер. Можно ли смоделировать случайный спиральный полимер как эффективную твердую сферу фиксированного диаметра? Измеренное исключение полиэтиленгликоля с разной молекулярной массой из белков, возможно (23, 24), согласуется с теснотой твердыми сферами (радиусы которых аппроксимируются радиусами вращения полимеров полиэтиленгликоля). Однако измерения с помощью молекулярного счетчика Коултера (25, 26) показывают, что полимеры полиэтиленгликоля разных размеров не всегда исключаются из четко определенных полостей, как того требует модель твердых сфер [e.g., рисунок 4 из Bezrukov et al. (25)]. Скорее, существует широкий диапазон частичного исключения в зависимости от размера молекулы.

    Предпочтительная гидратация

    Химическая природа растворенного вещества, а также его размер могут определять исключение из макромолекулярных поверхностей. Энергия взаимодействия фосфатной группы ДНК, например, с метиленовой группой триэтиленгликоля сильно отличается от энергии взаимодействия с водой. Тимашев (7, 27) сравнил этот механизм исключения растворенного вещества с открытых макромолекулярных поверхностей с увеличением поверхностного натяжения на границах раздела воздух-вода, вызванным полярными растворенными веществами и солями, которые также должны отражать исключение из этой конкретной границы раздела.Аналогия может быть дополнительно расширена путем построения разделяющей поверхности Гиббса для исключения растворенных веществ с открытых поверхностей белка, как это было проницательно сделано для влияния растворенных веществ на поверхностное натяжение воздух-вода (см. Приложение). Аракава и Тимашев (28) измерили зависимость свободных энергий исключения лактозы от площади поверхности белка. Наблюдаемое значение 1,5 кал / моль белка на моль лактозы на 2 Å площади поверхности переводится в эквивалентную разделяющую поверхность Гиббса, которая расположена на ∼ 4 Å от поверхности белка.Как будто на этом расстоянии (примерно один слой воды) не может быть обнаружена лактоза; снаружи будет основная концентрация лактозы. Энергия, необходимая для создания этой эквивалентной зоны, свободной от растворенного вещества, представляет собой работу осмотического давления растворенного вещества, умноженную на очищенный объем.

    Изученные нами макромолекулярные реакции, которые явно включают изменение площади экспонируемой поверхности, как, например, BZ-переход поли (dG-m 5 dC) (16) и связывание свободного E. coli gal. к его операторной последовательности (17), показал, что исключение каждого отдельного растворенного вещества может быть хорошо описано постоянным числом включенных вод, Δ N ew ab , (в диапазоне используемых концентраций растворенного вещества) , но эта разница в избыточном количестве воды между двумя состояниями очень чувствительна как к размеру, так и к химической природе растворенного вещества, исследующего реакцию.

    Перспективы

    Наш интерес к измерению количества воды, вытесняемой в макромолекулярных реакциях, основан на прямом измерении сил между макромолекулами. В этом случае макроскопические конденсированные массивы упорядоченных макромолекул уравновешиваются раствором полимера, который исключен из макромолекулярной фазы (обычно полиэтиленгликоль), и расстояния между макромолекулами измеряются (обычно с помощью рассеяния рентгеновских лучей) как функция осмотического давления полимера.Кривые зависимости термодинамической силы от расстояния были измерены для всех классов биологических макромолекул, липидных бислоев, ДНК, некоторых полисахаридов и белков. Поразительной особенностью этих сил является их сходство для всех очень разных систем, заряженных, нейтральных или полностью незаряженных. Мы интерпретировали эти измерения как указание на то, что макромолекулярные взаимодействия в последние 10–15 Å разделения преобладают за счет структурирования воды между поверхностями (29). Эти силы гидратации намного сильнее на близких расстояниях, чем ван-дер-ваальсовы или электростатические взаимодействия, которые обычно считаются важными.С этой точки зрения ключ к пониманию силы и специфичности, которые характеризуют большинство биологически важных реакций распознавания, находится в воде, которая высвобождается при сопряжении двух взаимодополняющих поверхностей.

    Независимо от того, какую точку зрения предпочитают думать о последствиях исключения растворенного вещества или полимера на реакции между макромолекулярными состояниями или конформациями, индуцированных энергий может быть достаточно, чтобы изменить конформации отдельных состояний. Можно не только измерить изменение исключения растворенного вещества, вызванное закрытием расщелины активного сайта гексокиназы связыванием глюкозы, но также, по-видимому, можно использовать сильное исключение растворенного вещества, чтобы закрыть щель даже в отсутствие глюкозы (4).Теперь можно начать отделить механику открытия и закрытия расщелины от энергетики связывания глюкозы. С помощью подхода осмотического стресса можно не только измерить разницу в секвестрированной воде между дезокси и лигандными конформациями димерного гемоглобина Scapharca , но также и высокие осмотические давления, по-видимому, способные изменить конформацию дезокси-формы на лигандную структуру даже в отсутствие лиганда (30). Не только может быть разница в изолированной воде между комплексами рестрикционной нуклеазы Eco RI, которые специфически и неспецифически связаны с ДНК, но и высокое осмотическое давление может удалить эту изолированную воду из неспецифических комплексов с определенными последовательностями ДНК, которые тесно связаны с ДНК. специфическая связывающая последовательность, но не другие (31).

    Это лишь несколько обнадеживающих примеров того, что можно узнать о макромолекулах, если внимательно посмотреть на их реакцию на активность воды.

    Благодарности

    Мы благодарим Чарльза Андерсона, Сергея Безрукова, Виктора Блумфилда, Дональда Каспара, Брэда Чейреса, Эрнеста Грюнвальда, Джека Корнблатта, Джеймса Ли, Сергея Лейкина, Марию МакГи, Аллана Минтона, Питера Николлса, Чарльза Спинка и Томаса Рекорда за полезное обсуждение или переписка.

    Подсчет количества молекул, адсорбированных на макромолекуле или отталкиваемых от нее

    Среди наиболее сложных концепций физической биохимии — как оценить количество молекул, связанных / притягиваемых или отталкиваемых от макромолекулы.Путаница особенно серьезна, когда происходит скопление или отталкивание небольших молекул около макромолекулы, а не чистое фиксированное связывание.

    Как и во многих термодинамических задачах, проблема была решена и концептуально решена Гиббсом. Рассмотрим изменение энергии поверхности, вызванное добавлением растворенного вещества в раствор, омывающий ее. Изотерма адсорбции Гиббса говорит, что свободная энергия поверхности будет уменьшаться с увеличением химического потенциала растворенного вещества прямо пропорционально плотности Γ растворенных веществ, связанных с поверхностью: dG = -Γ d μ растворенное вещество .Связанный означает избыточное количество молекул растворенного вещества, N es , на поверхности или около нее по сравнению с количеством растворенных веществ, которые могут находиться в том же объеме основного раствора.

    Точно так же отталкивание от поверхности, отрицательное значение N es , означает, что раствор вблизи макромолекул должен быть очищен от растворенных веществ, что требует затрат энергии. Повышенный химический потенциал растворенного вещества в ванне выталкивает растворенное вещество на поверхность и увеличивает стоимость очистки.

    Один из способов визуализировать энергетические затраты на исключение растворенного вещества — это признать, что существует изменение числовой плотности N ( x ) вблизи поверхности, отклонение от объемной плотности, N растворенное вещество (∞) . Если мы рассмотрим бесконечную плоскую поверхность, контактирующую с водным раствором растворенного вещества, связь между изменениями свободной энергии поверхности и изменениями химического потенциала растворенного вещества и воды происходит через это изменение концентрации растворенного вещества,

    A1

    Еще раз, соотношение Гиббса-Дюгема для видов, удаленных от поверхности, N растворенное вещество (∞) d μ растворенное вещество + N растворитель (∞) d μ растворитель = 0, делает это уравнение практическое.Интеграл по удаленной от поверхности области становится равным

    A2

    Свободная энергия поверхности изменяется только в той степени, в которой отношение растворенного вещества к растворителю отличается от соотношения в объеме.

    Макромолекула и притягиваемые / отталкиваемые компоненты ее раствора для купания действуют вместе одинаково. Для растворов, разбавленных макромолекулами, свойства этого раствора пропорциональны концентрации макромолекул. Можно интегрировать избыточное количество [ N i N i (∞)] всех частиц во всем пространстве вокруг каждой макромолекулы в духе изотермы адсорбции Гиббса.

    Двухзонные модели исключения одного растворенного вещества (32) и уравнения. A2 может быть соединен конструкцией разделяющей поверхности Гиббса, которая заменяет фактический профиль растворенного вещества N растворенного вещества ( x ) ступенчатой ​​функцией по концентрации от 0 до N растворенного вещества (∞). Расположение разделяющей поверхности, X Gibbs , фиксировано, чтобы обеспечить такой же поверхностный дефицит растворенного вещества, как и фактический градиент, или ∫ 0 [ N ( x ) — N растворенное вещество ( x )] dx = — N растворенное вещество (∞) X Gibbs .Таким образом, энергия, связанная с созданием этой прозрачной зоны, может рассматриваться как работа, необходимая для выталкивания полупроницаемой мембраны (проницаемой для воды, но не для растворенных веществ) с поверхности с размером x = 0 до x Gibbs . Это смещение вызывает осмотическую работу на единицу площади Π осмотический X Гиббс = кТ N растворенное вещество (∞) X Гиббс , в пределе Вант-Гоффа. Изящным применением этого рассуждения является теория Онзагера-Самараса о повышении поверхностного натяжения при добавлении сильного электролита в раствор (33).По мере того как соль отталкивается от поверхности, для ее создания требуется больше работы.

    Сноски

    § Инертное растворенное вещество в соответствии с определением, наложенным Тимашефф, — это вещество, которое взаимодействует с макромолекулой так же сильно (или так же слабо), как вода: N s / N w = n s / n w . В этом случае уравнения 5а и 5b, растворенное вещество, конечно, не может влиять на химический потенциал макромолекулы.

    Список литературы

    8. Грюнвальд Э. Термодинамика молекулярных частиц. Нью-Йорк: Уайли; 1997. [Google Scholar] 9. Asakura S, Oosawa F. J. Polym Sci. 1958; 33: 183–192. [Google Scholar] 16. Прейслер Р. С., Чен Х. Х., Коломбо М. К., Чоу Й., Шорт Б. Дж., Рау Д. К. Биохимия. 1995; 34: 14400–14407. [PubMed] [Google Scholar] 20. Прути М.С., Шехтер А.Н., Парсегян В.А., J. Mol Biol. 1985; 184: 517–528. [PubMed] [Google Scholar] 22. Динсмор А., Вонг Д. Т., Нельсон П., Йод А. Г. Phys Rev Lett. 1999. 80: 409–412.[Google Scholar] 23. Уиллс П. Р., Георгалис Й., Дейк Дж., Винзор Д. Biophys Chem. 1995; 57: 103–110. [PubMed] [Google Scholar] 25. Безруков С. М., Водяной И., Парсегян В. А. Природа (Лондон) 1994; 370: 279–281. [PubMed] [Google Scholar] 26. Безруков С. М., Водяной И., Брутян Р. А., Касьянович Дж. Макромолекулы. 1996; 29: 8517–8522. [Google Scholar] 29. Лейкин С., Парсегян В. А., Рау Д. К. Annu Rev Phys Chem. 1993; 44: 369–395. [PubMed] [Google Scholar] 32. Рекорд М. Т., младший, Чжан В., Андерсон С. Ф. Adv Protein Chem. 1998. 51: 281–353.[PubMed] [Google Scholar] 33. Ландау Л. Д., Лифшиц Е. М. Статистическая физика, Часть I. 3-е изд. Оксфорд: Пергамон; 1980., разделы 157 и 158. [Google Scholar]

    Осмотический стресс, скученность, предпочтительная гидратация и связывание: сравнение перспектив

    Proc Natl Acad Sci U S. A. 2000, 11 апреля; 97 (8): 3987–3992.

    Биофизика

    В. А. Парсегян

    * Лаборатория физической и структурной биологии, Национальный институт здоровья детей и развития человека, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд 20892-5626; и Департамент биологических наук, Университет Брока, Санкт-Петербург.Catharines, ON, L2S 3A1 Canada

    R. P. Rand

    * Лаборатория физической и структурной биологии, Национальный институт здоровья детей и развития человека, Национальные институты здравоохранения, Бетезда, Мэриленд 20892-5626; и Департамент биологических наук, Университет Брока, Сент-Катаринс, Онтарио, L2S 3A1 Канада

    DC Rau

    * Лаборатория физической и структурной биологии, Национальный институт здоровья детей и развития человека, Национальные институты здравоохранения , Bethesda, MD 20892-5626; и Департамент биологических наук, Университет Брока, Санкт-Петербург.Catharines, ON, L2S 3A1 Canada

    * Лаборатория физической и структурной биологии, Национальный институт здоровья детей и развития человека, Национальные институты здравоохранения, Бетезда, Мэриленд 20892-5626; и Департамент биологических наук, Университет Брока, Сент-Катаринс, Онтарио, L2S 3A1 Канада

    Кому запросы на перепечатку следует направлять по адресу: Building 12A, Room 2041, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20892- 5626. Электронная почта: [email protected]

    Передано Дональдом Л. Д. Каспаром, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида

    Получено 19 октября 1999 г .; Принято 13 января 2000 г.

    Copyright © 2000, Национальная академия наук

    Abstract

    В последнее время возникла большая путаница относительно относительных достоинств различных подходов, осмотического стресса, преимущественного взаимодействия и скопления, для описания косвенного воздействия растворенных веществ на макромолекулярные конформации и реакции.Чтобы усилить все интерпретации измерений и предотвратить дальнейшую ненужную концептуальную или лингвистическую путаницу, мы показываем здесь, как можно согласовать разные точки зрения. Наш подход основан на соотношении Гиббса-Дюгема, универсальном ограничении на количество способов, которыми можно изменить температуру, давление и химические потенциалы нескольких компонентов в любой термодинамически определенной системе. Из этого общего уравнения Гиббса-Дюгема можно увидеть эквивалентность различных точек зрения и даже показать точную идентичность более специализированных уравнений, используемых в различных подходах.

    Популярное и поучительное приложение осмотического стресса (1) было использовано для измерения изменений макромолекулярной гидратации для нескольких реакций. При переходе от полностью дезокси к полностью насыщенным кислородом формам гемоглобин загружает около 60 молекул воды (2). Переходя от закрытого к последовательному открытому состоянию, ионные каналы аламетицина поглощают 100 вод (3). Укусив глюкозу, гексокиназа вытесняет 320 молекул воды (4). Неспецифический ДНК-комплекс рестрикционной нуклеазы Eco RI секвестрирует примерно на 110 вод больше, чем специфический комплекс (5).Это воды, которые предпочтительно связаны с белком или макромолекулой или диссоциированы с ними, воды, отводимые или выделяемые в растворенные вещества в среде для купания. Такие количественные измерения воды как лиганда возможны, когда можно продемонстрировать, что работа по созданию различных макромолекулярных состояний изменяется пропорционально химическому потенциалу воды, а не химическим потенциалам агентов, используемых для изменения активности воды.

    В то же время растет осознание того, что молекулы в клетке стерически «теснят» друг друга в их совместно обитаемом водном пространстве (6) и что это стерическое взаимодействие может быть усилено за счет предпочтительной гидратации молекул (7).Мощные перспективы осмотического стресса, предпочтительной гидратации и скученности являются результатом общего происхождения теории растворов (8). В частности, теория растворов может быть специализирована для распознавания косвенного воздействия растворенных веществ на макромолекулы, которое происходит в дополнение к прямому действию определенных растворенных веществ через связывание с макромолекулами.

    Провидческие работы Асакуры и Осавы (9), а также ранние работы Танфорда (10) и Тимашева (7) побудили всех нас увидеть различные способы взаимодействия молекул друг с другом.В принципе (10) и на практике (11) растворенное вещество может иметь двоякий эффект. Та же самая молекула, которая напрямую связывается с белком, также может косвенно влиять на конформацию белка через изменения активности воды. Современные количественные исследования конкретных систем показали, что можно сознательно выбирать между различными точками зрения в зависимости от того, как макромолекулы реагируют на добавление растворенных веществ. На практике каждая из этих различных точек зрения может быть поучительной в зависимости от макромолекулярной системы, плана эксперимента и наблюдаемых свойств.

    И изображения скученности, и предпочтительной гидратации сосредоточены на свойствах растворенных веществ, которые исключены из макромолекул. Осмотический стресс подчеркивает роль воды, которая обязательно включается, если исключены растворенные вещества. В частности, составы краудинга используют размер и геометрию растворенных веществ или полимеров в растворе для расчета вклада отталкивания твердого ядра в свободную энергию макромолекулы непосредственно, например, с помощью теории масштабированных частиц. И предпочтительная гидратация, и осмотический стресс основаны на уравнении Гиббса-Дюгема.

    Эти разные взгляды на молекулярное действие дополняют друг друга, а не исключают друг друга. Недавно Тимашев (12) поставил под сомнение применение осмотического стресса к отдельным молекулам. Он утверждает, что подход к осмотическому стрессу «включает конфликт с законами термодинамики», но затем, в том же предложении, снимает осмотический стресс, говоря, что это «просто ограниченный случай предпочтительных взаимодействий, практикуемых в течение трех десятилетий». Его критика дополнительно осложняется признанием того, что подход осмотического стресса дает правильные числа:

    «Парадокс состоит в том, что, хотя теоретическая основа, представленная в осмотическом стрессе, неверна, эксперименты дали правильные числовые значения изменений предпочтительного гидратация, δ (∂ м 1 / ∂ м 2 ), поскольку на графиках использовались [уравнения, такие как уравнения.3 и 6 и их варианты] верны ».

    Нет никакого парадокса. Если бы Тимашев преобразовал свои символы в символы, используемые в анализе осмотического стресса, он бы успокоил себя, что осмотический стресс и анализ предпочтительной гидратации используют эквивалентные уравнения. Предполагаемый конфликт осмотического напряжения с термодинамическими законами возникает из-за особой интерпретации «инертности», наложенной Тимашевым, интерпретации, которая сама по себе противоречит явному термодинамическому использованию уравнения Гиббса-Дюгема.Его конкретное использование заставляет его думать, что энергетические последствия исключения растворенных веществ или сорастворителей были проигнорированы и что сохранение энергии нарушено. Это не тот случай.

    Вместо того, чтобы быть «ограниченным случаем предпочтительных взаимодействий» (12), анализ осмотического напряжения может фактически дать не только более четкую картину того, что происходит между макромолекулой и всеми компонентами раствора, но и прямой термодинамический показатель достигнутой гидратации. после измерения осмотического стресса с несколькими видами растворенных веществ.Хотя «термодинамика — прекрасная структура без содержания» (приписывается Аарону Качальски), эта структура является платформой, на которой мы можем организовать наши мысли о факторах, которые управляют стабильностью и функцией макромолекул.

    Термодинамические ограничения связывают различные точки зрения

    Уравнение Гиббса-Дюгема

    1

    определяет ограничения между изменениями температуры T , гидростатического давления p и химических потенциалов μ i компонента виды, входящие в состав препарата.Любое нарушение этого ограничения нарушает закон сохранения энергии. Взвешенный по энтропии S , объем v и количество молекул n i , по крайней мере одна из этих переменных ( T , p , μ i ) должна измениться, чтобы учесть любое изменение Другая.

    Макромолекула будет оказывать влияние на окружающие растворы, привлекая и накапливая одни виды, отталкивая другие. Традиционной отправной точкой для анализа взаимодействия компонентов раствора с макромолекулами является рассмотрение эксперимента по равновесному диализу.Мы рассматриваем для простоты комбинацию только трех видов: водный растворитель w , макромолекула M и малое растворенное вещество s . ( w , M и s иногда обозначаются 1, 2 и 3 соответственно, см. Таблицу). Раствор макромолекул, содержащий N w и N s молекул воды и растворенного вещества на макромолекулу, находится на одной стороне полупроницаемой мембраны. Этот раствор находится в равновесии со стандартным раствором, содержащим молекулы воды и растворенных веществ n w и n s .

    Таблица 1

    s / n w
    Тимашев (12) Парсегян, Рэнд и Рау (1)
    1 или w , вода w , вода
    макромолекула M , макромолекула
    3, сорастворитель с , растворенное вещество
    м x / м w , с

    8 9014 = 3

    x , B 3 N s
    w , B

    8

    1 62 90
    N w
    x — ( м x / м w ) v̄ w или B 3 — ( м 90 061 3 / м 1 ) B 1 N s N w ( n s / n w )
    [ср.уравнения 2 и 3b Тимашева (2)] (ср. уравнения 5a и 6a в настоящей статье)
    δ B 3 N s b N с a = Δ N с ab
    δ B 1 N w b N w a = Δ N w ab

    Затем для препаратов, хранящихся при постоянном давлении p и постоянной температуре T , ограничение Гиббса-Дюгема связывает изменение химического потенциала макромолекул или свободной энергии с изменениями в химическом потенциале растворенного вещества и воды,

    2

    Эталонный раствор имеет собственное ограничение Гиббса-Дюгема,

    3

    , которое требует, чтобы изменения химического потенциала воды и золя Они обязательно связаны:

    4

    Благодаря этой связи μ s ↔ μ w можно наблюдать прямое и косвенное влияние растворенных веществ и воды на макромолекулы.

    В искусстве диализной мембраны часто нет необходимости, если измерения проводятся на препаратах, достаточно разбавленных в макромолекуле, чтобы наблюдаемое поведение не учитывало вклады от взаимодействий между макромолекулами. Затем с полной строгостью мы можем думать о каждой макромолекуле как о растворенном растворе, в котором фактически нет других макромолекул. В этом пределе вода и растворенные вещества находятся в таком избытке, что наличие полупроницаемой мембраны излишне (рис.). Каждую макромолекулу можно рассматривать как находящуюся в равновесии с областями раствора, которые находятся достаточно далеко от макромолекулы, чтобы эти области имели те же свойства, что и эталонный раствор без макромолекул. В этих областях соотношение концентраций растворенного вещества / воды такое же, как и в сконструированном контрольном растворе. Можно представить себе, что каждая гидратированная молекула окружена собственной эффективной мембраной, различающей купающиеся виды (рис.).

    Разбавленные макромолекулы уравновешиваются основным раствором, который содержит соотношение растворенного вещества к воде n s / n w растворенного вещества.В области вокруг макромолекулы отношение растворенного вещества к воде, N s / N w , может отличаться от массы по разным причинам. Если это соотношение отличается между двумя конформациями макромолекулы, обозначенными здесь a и b , то влияние химического потенциала растворенного вещества или воды на равновесие можно описать уравнением. 5 . N s и N w должны рассматриваться как совокупный избыток или дефицит Гиббса (Приложение), т.е.е., как N s / N w отличается от n s / n w .

    Схематическое изображение того, как растворенные вещества могут вызывать осмотический стресс в различных системах в результате их исключения. Растворенное вещество можно стерически исключить из заполненных водой полостей, канавок, каналов или других подобных замкнутых объемов. Точки зрения скученности и предпочтительной гидратации, в частности, касаются исключения растворенных веществ с открытых макромолекулярных поверхностей.

    Можно сместить координаты, поместить отдельную макромолекулу в центр нашего мышления. Теперь мы запишем G s исходя из идеи свободной энергии Гиббса, а не мкс для той части химического потенциала, которая не зависит от концентрации макромолекул. При постоянной, разбавленной концентрации макромолекул изменение свободной энергии все еще описывается уравнением. 2, d μ M = — N w d μ w N s d μ s , но это соотношение экспериментально непрактично без ограничения уравнения .4 так что

    5a

    или

    5b

    N ew — избыточное (или дефицитное) количество вод в окрестностях макромолекулы; N es — избыточное (или недостаточное) количество растворенных веществ. Эти числа полностью аналогичны избытку (или дефициту) поверхности Гиббса, который описывает изменение свободной энергии поверхности при добавлении привлеченных или отталкиваемых растворенных веществ (см. Приложение).

    Изменение химического потенциала растворенного вещества d μ с равно d [ kT ln ( a s )], где a s — активность растворенного вещества, или d μ s = d [ kT ln (γ C s )], где γ — коэффициент активности растворенного вещества, а C s — его концентрация.Аналогично, изменение химического потенциала воды d μ w равно −V̄ w d Π, где V̄ w — молекулярный объем воды, а d Π — дополнительный вклад в осмотическое давление. раствора из добавленного растворенного вещества. Осмотическое давление — это, конечно, коллигативное свойство раствора; это зависит от активности всех компонентов. Однако в наших уравнениях и в эквивалентных уравнениях Тимашева активности всех компонентов, кроме одного растворенного вещества и воды, остаются постоянными.

    Должно быть очевидно, что если большая молекула не влияет на распределение растворенного вещества или воды, то добавленное растворенное вещество не влияет на свободную энергию макромолекулы. Только в той степени, в которой соотношение N s / N w растворенного вещества к воде вблизи макромолекулы отличается от их численного отношения n s / n w в При купании раствора произойдет изменение свободной энергии макромолекулы.Прямое связывание растворенных веществ с макромолекулой означает, что N s / N w > n s / n w ; или наоборот, если макромолекула притягивает воду сильнее, чем растворенное вещество, то N s / N w < n s / n w . Именно здесь Тимашев заявляет о конфликте с законами термодинамики из-за использования им слова инертный.Для нас инертное растворенное вещество — это вещество, которое не действует непосредственно на макромолекулу; нет ни реакции, ни связывания, которые вызывают изменение конформации макромолекулы. Один широкий класс таких инертных молекул — это естественные осмопротекторы, такие как бетаин и глицерин (13, 14). Это конкретное использование инертного является неотъемлемой частью термодинамического использования соотношения Гиббса-Дюгема. § В то же время особенности используемых агентов делают процедуру менее чисто термодинамической.

    Необходимость полупроницаемой мембраны определяется характером эксперимента. Для измерения N ew (или, что эквивалентно, N es ) для отдельных состояний a или b с помощью денситометрии, равновесного центрифугирования или рассеяния света (7, 15), например, требуется использование полупроницаемой мембраны, поскольку соотношения растворенных веществ и воды в эталонных растворах и растворах макромолекул определяются отдельно.Гидростатическое давление, возникающее из-за непроницаемой макромолекулы, будет влиять на распределение растворенного вещества и воды между двумя отсеками. Этот эффект незначителен в пределе разбавленного раствора. Для измерения разницы Δ N ew (или Δ N es ) между двумя состояниями макромолекул не требуется полупроницаемая мембрана, а требуется только метод определения концентрации или отношения вероятностей между двумя состояниями. Перераспределение растворенного вещества и воды вокруг макромолекулы будет влиять на объемную концентрацию растворенного вещества вдали от макромолекулы.Этот эффект также незначителен в пределе разбавленного раствора.

    Поучительные эксперименты — это те, которые включают переключение между аллостерическими состояниями, которые позволяют нам смотреть на различия в вероятностях состояний молекулы (как при открытии / закрытии ионных каналов) или на различия в концентрации (как при оксигенации гемоглобина), когда мы меняем раствор. условия. Если есть две формы макромолекулы a и b , отношение их концентраций (или их вероятностей) выражается в виде экспоненты в разности работы или свободной энергии Δ G ab = G b G a , необходимое для перехода отдельной молекулы между двумя формами, [ b ] / [ a ] = K eq = e (−Δ G ab / кТ ).

    Из уравнения. 5 , у нас

    6a

    или

    6b

    с Δ N ew ab = N ew b N ew a и Δ N es ab = N es b N es a . Наблюдаемое изменение отношения [ b ] / [ a ], следовательно, измеряет разницу в числах N ew или N es для двух состояний.

    Эти два уравнения и уравнения. 5a и 5b строго эквивалентны «фундаментальным уравнениям» 2, 3a и 3b Тимашева (12), потому что его m 3 / m 1 = n s / n w , δv̄ 3 = ( N s b N s a ) = Δ N s ab и δv̄ 1 = ( N w b N w a ) = Δ N w ab (полный перевод символов между двумя наборами уравнений см. В таблице).

    Ур. 6а эквивалентен стандартной изотерме адсорбции Гиббса, обычно используемой для расчета энергетических последствий прямого связывания растворенного вещества. В случаях, когда нет значительной разницы в количестве попутных вод, например, N w a = N w b , тогда, поскольку Δ N es ab = Δ N s ab , уравнение. 6b становится,

    7a

    или

    7b

    Для концентраций растворенных веществ, больших по сравнению с их константой диссоциации от макромолекулы, Δ N es ab является постоянным.Графики Δ G ab от Δμ s , как предписано уравнением. 7a, тогда линейны с наклонами, которые непосредственно дают Δ N s ab = N s b N s a . Применение уравнения. 7b дает нелинейные графики Δ G ab от Δμ w , которые не столь поучительны. В этих случаях различий в прямом связывании растворенного вещества с двумя состояниями макромолекулы имеет смысл использовать уравнение.7а, который связывает различия в химическом потенциале макромолекул с изменениями химического потенциала включенного растворенного вещества.

    В случаях, когда растворенные вещества исключаются нетто ( N s / N w < n s / n w ), коэффициент N ew в уравнении. 5b — это буквально чистое избыточное количество молекул воды, связанных или включенных в макромолекулу. Для макромолекулярной реакции или конформационного изменения из состояния a в состояние b , разностный член в уравнении.6b, Δ N ew ab , — это как раз разница между состояниями a и b в этом избыточном количестве вод, включенных в макромолекулу.

    На языке осмотического стресса уравнение. 6b теперь можно просто записать как изменение разности химических потенциалов между состояниями a и b , Δ G ab , в зависимости от изменения химического потенциала воды или осмотического давления,, и молекулярный объем воды, V ̄ w ,

    8

    В нескольких примерах, упомянутых Тимашевым (12), реакция открытия / закрытия мембранных каналов (3), оксигенация гемоглобина (2), связывание глюкозы гексокиназой (4), BZ-переходом поли (dG-m5dC) (16), оператором связывания репрессора гал-оперона (17), равновесием специфического / неспецифического связывания Eco RI (5), Δ G Было обнаружено, что ab в пределах экспериментальной точности изменяется линейно с осмотическим давлением Π в широком диапазоне концентраций растворенных веществ.Обычно эта линейность включает важный предел [растворенное вещество] → 0. Однако нельзя ожидать, что эта линейность распространится на сколь угодно высокие напряжения. При достаточно высоких концентрациях можно ожидать обмена исключенного растворенного вещества с предпочтительно включенной водой на открытых макромолекулярных поверхностях (18, 19). Кроме того, осмотическое напряжение в конечном итоге деформирует макромолекулу и искажает состояния a и b ; их отдельные N s и N w изменились бы с Π, чтобы дать искаженную оценку Δ N ew ab .

    Линейность Δ G ab относительно Π в этих нескольких случаях означает, что разница в избыточном количестве воды, включенной или связанной с двумя макромолекулярными состояниями, хорошо определена и остается постоянной по мере увеличения концентрации растворенного вещества. Константа Δ N ew ab не означает, что в примерах, перечисленных выше, нет связывания растворенных веществ с макромолекулами, а только то, что нет или очень мало различий в связывании растворенных веществ с двумя состояниями.Любая значительная разница в прямом связывании растворенного вещества с конкретными сайтами в двух макромолекулярных состояниях в дополнение к исключению будет иметь практический эффект, заключающийся в том, что кажущееся значение Δ N ew ab не будет постоянным и будет зависеть от активности растворенного вещества или , что то же самое, по осмотическому давлению. Двойная роль растворенного вещества наиболее четко прослеживается в эффекте хлорид-иона, который имеет как прямое связывание, так и механизмы действия, вызывающие осмотический стресс, на оксигенацию гемоглобина.Эти режимы были индивидуально измерены путем независимого изменения активности воды и активности хлорид-иона с использованием второго растворенного вещества (11).

    Эффекты и причины

    Перспектива осмотического стресса дает поучительно четкую картину причинных эффектов в растворах. Рис. Иллюстрирует две возможности, которые могут вызвать исключение растворенных веществ из макромолекулярного состояния. Макромолекула может иметь карманы или каналы для воды с отверстиями для основного раствора, которые просто слишком малы для проникновения растворенных веществ.Кроме того, растворенные вещества можно исключить с открытых макромолекулярных поверхностей. Перспективы скученности и предпочтительной гидратации были разработаны специально для учета этого последнего вида исключения. Измерения осмотического напряжения с несколькими растворенными веществами разного размера и химической природы, все эффекты которых линейно зависят от их вклада в химический потенциал воды, могут различать различные механизмы. Рис. Иллюстрирует наблюдаемые различия. На фиг. a показана зависимость свободной энергии связывания репрессора Escherichia coli gal с фрагментом ДНК, содержащим его операторную последовательность, от осмотического стресса для двух растворенных веществ, цвиттериона бетаинглицина и сравнительно неполярного триэтиленгликоля.Захоронение открытой поверхности сопровождает связывание свободного белка с ДНК. Фиг. b показывает зависимость изменения свободной энергии от осмотического давления для переноса рестрикционной нуклеазы Eco RI из комплекса с неспецифической ДНК к ее узнавающей последовательности, показанной для тех же двух растворенных веществ. В этой схеме избегается изменение площади поверхности, вызванное связыванием свободного белка. В обеих системах графики являются линейными, что указывает на то, что разница в количестве включенных вод между двумя сторонами реакции является постоянной во всем диапазоне исследуемых концентраций растворенных веществ.Существенная зависимость Δ N ew ab (уравнение 6a) от идентичности растворенного вещества для связывания свободного белка на фиг. a характерна для реакций, сопровождаемых значительными изменениями площади экспонированной поверхности. Соответствующая нечувствительность к идентичности растворенного вещества, наблюдаемая для переноса белка от одной последовательности ДНК к другой на рис. b , характерна для реакций, сопровождаемых доминирующими изменениями в количестве молекул воды, стерически изолированных в карманах или каналах.

    Наблюдаемая зависимость эффекта осмотического стресса от природы растворенного вещества дает представление об основе исключения. ( a ) Изменение энергии связывания репрессора E. coli с ДНК, содержащей его операторную последовательность, при увеличении концентрации растворенного вещества показано как функция осмотического давления растворенного вещества в осмоляльных единицах (данные взяты из ссылка 17). И бетаинглицин (●), и триэтиленгликоль (■), по-видимому, влияют на реакцию через разницу в N ew между свободным белком и ДНК в растворе и в комплексе.Однако разница в воде зависит от растворенного вещества; Δ N ew = 180 вод на комплекс для триэтиленгликоля и 100 для бетаинглицина. Это различие характерно для реакций, закапывающих открытую поверхность. ( b ) Зависимость от осмотического стресса разницы в энергии между специфическим связыванием рестрикционной нуклеазы Eco RI с фрагментом ДНК (ДНК2), который содержит его последовательность распознавания, и неспецифическим связыванием фермента с олигонуклеотидом ДНК ( ДНК1), который не несет последовательности распознавания.Это показано для тех же двух растворенных веществ, бетаинглицина (●) и триэтиленгликоля (■) (данные взяты из ссылки 8). В этом случае действие двух растворенных веществ идентично, в пределах экспериментальной ошибки, с Δ N ew = 110 вод. Этот результат характерен для реакций с изменением количества вод, которые изолированы в стерически недоступных карманах или полостях.

    Стерическое исключение из заполненных водой объемов

    Во многих работах по осмотическому стрессу использовались инертные растворенные вещества для определения изменений размера заполненных водой полостей, канавок, каналов или карманов, которые просто недоступны для растворенных веществ.Это исключение может быть обеспечено диализной мембраной, как это было сделано для реакции гелеобразования серповидного гемоглобина (20). Отличительной особенностью этих систем, например, реакцией открытия / закрытия нескольких каналов (3), оксигенацией гемоглобина (2) и равновесием специфического / неспецифического связывания Eco RI (5), является то, что Δ N ew ab незначительно или, в худшем случае, очень слабо изменяется в зависимости от типа растворенного вещества, используемого для изменения химического потенциала воды.Эти системы наиболее удобны для визуализации осмотического стресса. Опять же, может иметь место прямое связывание растворенного вещества и, скорее всего, исключение из открытых поверхностей, но разница в этом связывании или исключении из открытых поверхностей между двумя состояниями незначительна или отсутствует. Разница в количестве воды между двумя состояниями представляет собой реальный физический объем, который дает прямую информацию о структуре.

    Crowding

    Растворенные вещества часто не могут занимать область у стены или вблизи большой макромолекулярной поверхности.Эффект этого исключения заключается в создании сил истощения, которые сближают области, исключающие растворенные вещества (9). В раствор, содержащий растворенные вещества, выделяется некоторое количество молекул воды, Δ N ew . Эта классическая формула краудинга предполагает, что исключение растворенного вещества является чисто стерическим эффектом. Исключенные объемы рассчитываются на основе взаимодействия твердых сфер. Характерной чертой исключения краудинга является предсказуемая зависимость исключенного объема от размера растворенного вещества, но не от химической природы.Поскольку в рамках этой теоретической основы не рассматривается связывание растворенного вещества, лежащая в основе термодинамика в рамках подхода Гиббса-Дюгема может рассматриваться строго с точки зрения включенной воды. Действительно, в приближении первого порядка, часто используемом в анализе краудинга (например, ссылка 21), в котором пренебрегают взаимодействием растворенного вещества с растворенным веществом, обработка прозрачно дает изменение свободной энергии макромолекул, которое является произведением рассчитанного исключенного объема V̄ w Δ N ew , и приближение первого порядка к осмотическому давлению растворенного вещества (линейное по концентрации растворенного вещества в соответствии с законом Вант-Гоффа идеальных растворов).Расчетный исключенный объем может зависеть от осмотического давления, если включены члены более высокого порядка. Такие вычисления более высокого порядка трудны, потому что включение этих членов для самосогласованности также должно предсказывать осмотическое давление растворенных веществ. Чтобы избежать таких путаниц, в подходе осмотического стресса используются только измеренные осмотические давления.

    Уравнения состояния твердых частиц, которые используются для оценки скученности, могут дать геометрическое представление о космических войнах между молекулами. Для более крупных частиц в коллоидном масштабе силы истощения могут быть точно определены количественно (22).Однако для полимеров, действующих на белки, есть предположения, которые дают только качественную картину твердых сфер. Можно ли смоделировать случайный спиральный полимер как эффективную твердую сферу фиксированного диаметра? Измеренное исключение полиэтиленгликоля с разной молекулярной массой из белков, возможно (23, 24), согласуется с теснотой твердыми сферами (радиусы которых аппроксимируются радиусами вращения полимеров полиэтиленгликоля). Однако измерения с помощью молекулярного счетчика Коултера (25, 26) показывают, что полимеры полиэтиленгликоля разных размеров не всегда исключаются из четко определенных полостей, как того требует модель твердых сфер [e.g., рисунок 4 из Bezrukov et al. (25)]. Скорее, существует широкий диапазон частичного исключения в зависимости от размера молекулы.

    Предпочтительная гидратация

    Химическая природа растворенного вещества, а также его размер могут определять исключение из макромолекулярных поверхностей. Энергия взаимодействия фосфатной группы ДНК, например, с метиленовой группой триэтиленгликоля сильно отличается от энергии взаимодействия с водой. Тимашев (7, 27) сравнил этот механизм исключения растворенного вещества с открытых макромолекулярных поверхностей с увеличением поверхностного натяжения на границах раздела воздух-вода, вызванным полярными растворенными веществами и солями, которые также должны отражать исключение из этой конкретной границы раздела.Аналогия может быть дополнительно расширена путем построения разделяющей поверхности Гиббса для исключения растворенных веществ с открытых поверхностей белка, как это было проницательно сделано для влияния растворенных веществ на поверхностное натяжение воздух-вода (см. Приложение). Аракава и Тимашев (28) измерили зависимость свободных энергий исключения лактозы от площади поверхности белка. Наблюдаемое значение 1,5 кал / моль белка на моль лактозы на 2 Å площади поверхности переводится в эквивалентную разделяющую поверхность Гиббса, которая расположена на ∼ 4 Å от поверхности белка.Как будто на этом расстоянии (примерно один слой воды) не может быть обнаружена лактоза; снаружи будет основная концентрация лактозы. Энергия, необходимая для создания этой эквивалентной зоны, свободной от растворенного вещества, представляет собой работу осмотического давления растворенного вещества, умноженную на очищенный объем.

    Изученные нами макромолекулярные реакции, которые явно включают изменение площади экспонируемой поверхности, как, например, BZ-переход поли (dG-m 5 dC) (16) и связывание свободного E. coli gal. к его операторной последовательности (17), показал, что исключение каждого отдельного растворенного вещества может быть хорошо описано постоянным числом включенных вод, Δ N ew ab , (в диапазоне используемых концентраций растворенного вещества) , но эта разница в избыточном количестве воды между двумя состояниями очень чувствительна как к размеру, так и к химической природе растворенного вещества, исследующего реакцию.

    Перспективы

    Наш интерес к измерению количества воды, вытесняемой в макромолекулярных реакциях, основан на прямом измерении сил между макромолекулами. В этом случае макроскопические конденсированные массивы упорядоченных макромолекул уравновешиваются раствором полимера, который исключен из макромолекулярной фазы (обычно полиэтиленгликоль), и расстояния между макромолекулами измеряются (обычно с помощью рассеяния рентгеновских лучей) как функция осмотического давления полимера.Кривые зависимости термодинамической силы от расстояния были измерены для всех классов биологических макромолекул, липидных бислоев, ДНК, некоторых полисахаридов и белков. Поразительной особенностью этих сил является их сходство для всех очень разных систем, заряженных, нейтральных или полностью незаряженных. Мы интерпретировали эти измерения как указание на то, что макромолекулярные взаимодействия в последние 10–15 Å разделения преобладают за счет структурирования воды между поверхностями (29). Эти силы гидратации намного сильнее на близких расстояниях, чем ван-дер-ваальсовы или электростатические взаимодействия, которые обычно считаются важными.С этой точки зрения ключ к пониманию силы и специфичности, которые характеризуют большинство биологически важных реакций распознавания, находится в воде, которая высвобождается при сопряжении двух взаимодополняющих поверхностей.

    Независимо от того, какую точку зрения предпочитают думать о последствиях исключения растворенного вещества или полимера на реакции между макромолекулярными состояниями или конформациями, индуцированных энергий может быть достаточно, чтобы изменить конформации отдельных состояний. Можно не только измерить изменение исключения растворенного вещества, вызванное закрытием расщелины активного сайта гексокиназы связыванием глюкозы, но также, по-видимому, можно использовать сильное исключение растворенного вещества, чтобы закрыть щель даже в отсутствие глюкозы (4).Теперь можно начать отделить механику открытия и закрытия расщелины от энергетики связывания глюкозы. С помощью подхода осмотического стресса можно не только измерить разницу в секвестрированной воде между дезокси и лигандными конформациями димерного гемоглобина Scapharca , но также и высокие осмотические давления, по-видимому, способные изменить конформацию дезокси-формы на лигандную структуру даже в отсутствие лиганда (30). Не только может быть разница в изолированной воде между комплексами рестрикционной нуклеазы Eco RI, которые специфически и неспецифически связаны с ДНК, но и высокое осмотическое давление может удалить эту изолированную воду из неспецифических комплексов с определенными последовательностями ДНК, которые тесно связаны с ДНК. специфическая связывающая последовательность, но не другие (31).

    Это лишь несколько обнадеживающих примеров того, что можно узнать о макромолекулах, если внимательно посмотреть на их реакцию на активность воды.

    Благодарности

    Мы благодарим Чарльза Андерсона, Сергея Безрукова, Виктора Блумфилда, Дональда Каспара, Брэда Чейреса, Эрнеста Грюнвальда, Джека Корнблатта, Джеймса Ли, Сергея Лейкина, Марию МакГи, Аллана Минтона, Питера Николлса, Чарльза Спинка и Томаса Рекорда за полезное обсуждение или переписка.

    Подсчет количества молекул, адсорбированных на макромолекуле или отталкиваемых от нее

    Среди наиболее сложных концепций физической биохимии — как оценить количество молекул, связанных / притягиваемых или отталкиваемых от макромолекулы.Путаница особенно серьезна, когда происходит скопление или отталкивание небольших молекул около макромолекулы, а не чистое фиксированное связывание.

    Как и во многих термодинамических задачах, проблема была решена и концептуально решена Гиббсом. Рассмотрим изменение энергии поверхности, вызванное добавлением растворенного вещества в раствор, омывающий ее. Изотерма адсорбции Гиббса говорит, что свободная энергия поверхности будет уменьшаться с увеличением химического потенциала растворенного вещества прямо пропорционально плотности Γ растворенных веществ, связанных с поверхностью: dG = -Γ d μ растворенное вещество .Связанный означает избыточное количество молекул растворенного вещества, N es , на поверхности или около нее по сравнению с количеством растворенных веществ, которые могут находиться в том же объеме основного раствора.

    Точно так же отталкивание от поверхности, отрицательное значение N es , означает, что раствор вблизи макромолекул должен быть очищен от растворенных веществ, что требует затрат энергии. Повышенный химический потенциал растворенного вещества в ванне выталкивает растворенное вещество на поверхность и увеличивает стоимость очистки.

    Один из способов визуализировать энергетические затраты на исключение растворенного вещества — это признать, что существует изменение числовой плотности N ( x ) вблизи поверхности, отклонение от объемной плотности, N растворенное вещество (∞) . Если мы рассмотрим бесконечную плоскую поверхность, контактирующую с водным раствором растворенного вещества, связь между изменениями свободной энергии поверхности и изменениями химического потенциала растворенного вещества и воды происходит через это изменение концентрации растворенного вещества,

    A1

    Еще раз, соотношение Гиббса-Дюгема для видов, удаленных от поверхности, N растворенное вещество (∞) d μ растворенное вещество + N растворитель (∞) d μ растворитель = 0, делает это уравнение практическое.Интеграл по удаленной от поверхности области становится равным

    A2

    Свободная энергия поверхности изменяется только в той степени, в которой отношение растворенного вещества к растворителю отличается от соотношения в объеме.

    Макромолекула и притягиваемые / отталкиваемые компоненты ее раствора для купания действуют вместе одинаково. Для растворов, разбавленных макромолекулами, свойства этого раствора пропорциональны концентрации макромолекул. Можно интегрировать избыточное количество [ N i N i (∞)] всех частиц во всем пространстве вокруг каждой макромолекулы в духе изотермы адсорбции Гиббса.

    Двухзонные модели исключения одного растворенного вещества (32) и уравнения. A2 может быть соединен конструкцией разделяющей поверхности Гиббса, которая заменяет фактический профиль растворенного вещества N растворенного вещества ( x ) ступенчатой ​​функцией по концентрации от 0 до N растворенного вещества (∞). Расположение разделяющей поверхности, X Gibbs , фиксировано, чтобы обеспечить такой же поверхностный дефицит растворенного вещества, как и фактический градиент, или ∫ 0 [ N ( x ) — N растворенное вещество ( x )] dx = — N растворенное вещество (∞) X Gibbs .Таким образом, энергия, связанная с созданием этой прозрачной зоны, может рассматриваться как работа, необходимая для выталкивания полупроницаемой мембраны (проницаемой для воды, но не для растворенных веществ) с поверхности с размером x = 0 до x Gibbs . Это смещение вызывает осмотическую работу на единицу площади Π осмотический X Гиббс = кТ N растворенное вещество (∞) X Гиббс , в пределе Вант-Гоффа. Изящным применением этого рассуждения является теория Онзагера-Самараса о повышении поверхностного натяжения при добавлении сильного электролита в раствор (33).По мере того как соль отталкивается от поверхности, для ее создания требуется больше работы.

    Сноски

    § Инертное растворенное вещество в соответствии с определением, наложенным Тимашефф, — это вещество, которое взаимодействует с макромолекулой так же сильно (или так же слабо), как вода: N s / N w = n s / n w . В этом случае уравнения 5а и 5b, растворенное вещество, конечно, не может влиять на химический потенциал макромолекулы.

    Список литературы

    8. Грюнвальд Э. Термодинамика молекулярных частиц. Нью-Йорк: Уайли; 1997. [Google Scholar] 9. Asakura S, Oosawa F. J. Polym Sci. 1958; 33: 183–192. [Google Scholar] 16. Прейслер Р. С., Чен Х. Х., Коломбо М. К., Чоу Й., Шорт Б. Дж., Рау Д. К. Биохимия. 1995; 34: 14400–14407. [PubMed] [Google Scholar] 20. Прути М.С., Шехтер А.Н., Парсегян В.А., J. Mol Biol. 1985; 184: 517–528. [PubMed] [Google Scholar] 22. Динсмор А., Вонг Д. Т., Нельсон П., Йод А. Г. Phys Rev Lett. 1999. 80: 409–412.[Google Scholar] 23. Уиллс П. Р., Георгалис Й., Дейк Дж., Винзор Д. Biophys Chem. 1995; 57: 103–110. [PubMed] [Google Scholar] 25. Безруков С. М., Водяной И., Парсегян В. А. Природа (Лондон) 1994; 370: 279–281. [PubMed] [Google Scholar] 26. Безруков С. М., Водяной И., Брутян Р. А., Касьянович Дж. Макромолекулы. 1996; 29: 8517–8522. [Google Scholar] 29. Лейкин С., Парсегян В. А., Рау Д. К. Annu Rev Phys Chem. 1993; 44: 369–395. [PubMed] [Google Scholar] 32. Рекорд М. Т., младший, Чжан В., Андерсон С. Ф. Adv Protein Chem. 1998. 51: 281–353.[PubMed] [Google Scholar] 33. Ландау Л. Д., Лифшиц Е. М. Статистическая физика, Часть I. 3-е изд. Оксфорд: Пергамон; 1980., разделы 157 и 158. [Google Scholar]

    Осмотический стресс, скученность, предпочтительная гидратация и связывание: сравнение перспектив

    Proc Natl Acad Sci U S. A. 2000, 11 апреля; 97 (8): 3987–3992.

    Биофизика

    В. А. Парсегян

    * Лаборатория физической и структурной биологии, Национальный институт здоровья детей и развития человека, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд 20892-5626; и Департамент биологических наук, Университет Брока, Санкт-Петербург.Catharines, ON, L2S 3A1 Canada

    R. P. Rand

    * Лаборатория физической и структурной биологии, Национальный институт здоровья детей и развития человека, Национальные институты здравоохранения, Бетезда, Мэриленд 20892-5626; и Департамент биологических наук, Университет Брока, Сент-Катаринс, Онтарио, L2S 3A1 Канада

    DC Rau

    * Лаборатория физической и структурной биологии, Национальный институт здоровья детей и развития человека, Национальные институты здравоохранения , Bethesda, MD 20892-5626; и Департамент биологических наук, Университет Брока, Санкт-Петербург.Catharines, ON, L2S 3A1 Canada

    * Лаборатория физической и структурной биологии, Национальный институт здоровья детей и развития человека, Национальные институты здравоохранения, Бетезда, Мэриленд 20892-5626; и Департамент биологических наук, Университет Брока, Сент-Катаринс, Онтарио, L2S 3A1 Канада

    Кому запросы на перепечатку следует направлять по адресу: Building 12A, Room 2041, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20892- 5626. Электронная почта: [email protected]

    Передано Дональдом Л. Д. Каспаром, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида

    Получено 19 октября 1999 г .; Принято 13 января 2000 г.

    Copyright © 2000, Национальная академия наук

    Abstract

    В последнее время возникла большая путаница относительно относительных достоинств различных подходов, осмотического стресса, преимущественного взаимодействия и скопления, для описания косвенного воздействия растворенных веществ на макромолекулярные конформации и реакции.Чтобы усилить все интерпретации измерений и предотвратить дальнейшую ненужную концептуальную или лингвистическую путаницу, мы показываем здесь, как можно согласовать разные точки зрения. Наш подход основан на соотношении Гиббса-Дюгема, универсальном ограничении на количество способов, которыми можно изменить температуру, давление и химические потенциалы нескольких компонентов в любой термодинамически определенной системе. Из этого общего уравнения Гиббса-Дюгема можно увидеть эквивалентность различных точек зрения и даже показать точную идентичность более специализированных уравнений, используемых в различных подходах.

    Популярное и поучительное приложение осмотического стресса (1) было использовано для измерения изменений макромолекулярной гидратации для нескольких реакций. При переходе от полностью дезокси к полностью насыщенным кислородом формам гемоглобин загружает около 60 молекул воды (2). Переходя от закрытого к последовательному открытому состоянию, ионные каналы аламетицина поглощают 100 вод (3). Укусив глюкозу, гексокиназа вытесняет 320 молекул воды (4). Неспецифический ДНК-комплекс рестрикционной нуклеазы Eco RI секвестрирует примерно на 110 вод больше, чем специфический комплекс (5).Это воды, которые предпочтительно связаны с белком или макромолекулой или диссоциированы с ними, воды, отводимые или выделяемые в растворенные вещества в среде для купания. Такие количественные измерения воды как лиганда возможны, когда можно продемонстрировать, что работа по созданию различных макромолекулярных состояний изменяется пропорционально химическому потенциалу воды, а не химическим потенциалам агентов, используемых для изменения активности воды.

    В то же время растет осознание того, что молекулы в клетке стерически «теснят» друг друга в их совместно обитаемом водном пространстве (6) и что это стерическое взаимодействие может быть усилено за счет предпочтительной гидратации молекул (7).Мощные перспективы осмотического стресса, предпочтительной гидратации и скученности являются результатом общего происхождения теории растворов (8). В частности, теория растворов может быть специализирована для распознавания косвенного воздействия растворенных веществ на макромолекулы, которое происходит в дополнение к прямому действию определенных растворенных веществ через связывание с макромолекулами.

    Провидческие работы Асакуры и Осавы (9), а также ранние работы Танфорда (10) и Тимашева (7) побудили всех нас увидеть различные способы взаимодействия молекул друг с другом.В принципе (10) и на практике (11) растворенное вещество может иметь двоякий эффект. Та же самая молекула, которая напрямую связывается с белком, также может косвенно влиять на конформацию белка через изменения активности воды. Современные количественные исследования конкретных систем показали, что можно сознательно выбирать между различными точками зрения в зависимости от того, как макромолекулы реагируют на добавление растворенных веществ. На практике каждая из этих различных точек зрения может быть поучительной в зависимости от макромолекулярной системы, плана эксперимента и наблюдаемых свойств.

    И изображения скученности, и предпочтительной гидратации сосредоточены на свойствах растворенных веществ, которые исключены из макромолекул. Осмотический стресс подчеркивает роль воды, которая обязательно включается, если исключены растворенные вещества. В частности, составы краудинга используют размер и геометрию растворенных веществ или полимеров в растворе для расчета вклада отталкивания твердого ядра в свободную энергию макромолекулы непосредственно, например, с помощью теории масштабированных частиц. И предпочтительная гидратация, и осмотический стресс основаны на уравнении Гиббса-Дюгема.

    Эти разные взгляды на молекулярное действие дополняют друг друга, а не исключают друг друга. Недавно Тимашев (12) поставил под сомнение применение осмотического стресса к отдельным молекулам. Он утверждает, что подход к осмотическому стрессу «включает конфликт с законами термодинамики», но затем, в том же предложении, снимает осмотический стресс, говоря, что это «просто ограниченный случай предпочтительных взаимодействий, практикуемых в течение трех десятилетий». Его критика дополнительно осложняется признанием того, что подход осмотического стресса дает правильные числа:

    «Парадокс состоит в том, что, хотя теоретическая основа, представленная в осмотическом стрессе, неверна, эксперименты дали правильные числовые значения изменений предпочтительного гидратация, δ (∂ м 1 / ∂ м 2 ), поскольку на графиках использовались [уравнения, такие как уравнения.3 и 6 и их варианты] верны ».

    Нет никакого парадокса. Если бы Тимашев преобразовал свои символы в символы, используемые в анализе осмотического стресса, он бы успокоил себя, что осмотический стресс и анализ предпочтительной гидратации используют эквивалентные уравнения. Предполагаемый конфликт осмотического напряжения с термодинамическими законами возникает из-за особой интерпретации «инертности», наложенной Тимашевым, интерпретации, которая сама по себе противоречит явному термодинамическому использованию уравнения Гиббса-Дюгема.Его конкретное использование заставляет его думать, что энергетические последствия исключения растворенных веществ или сорастворителей были проигнорированы и что сохранение энергии нарушено. Это не тот случай.

    Вместо того, чтобы быть «ограниченным случаем предпочтительных взаимодействий» (12), анализ осмотического напряжения может фактически дать не только более четкую картину того, что происходит между макромолекулой и всеми компонентами раствора, но и прямой термодинамический показатель достигнутой гидратации. после измерения осмотического стресса с несколькими видами растворенных веществ.Хотя «термодинамика — прекрасная структура без содержания» (приписывается Аарону Качальски), эта структура является платформой, на которой мы можем организовать наши мысли о факторах, которые управляют стабильностью и функцией макромолекул.

    Термодинамические ограничения связывают различные точки зрения

    Уравнение Гиббса-Дюгема

    1

    определяет ограничения между изменениями температуры T , гидростатического давления p и химических потенциалов μ i компонента виды, входящие в состав препарата.Любое нарушение этого ограничения нарушает закон сохранения энергии. Взвешенный по энтропии S , объем v и количество молекул n i , по крайней мере одна из этих переменных ( T , p , μ i ) должна измениться, чтобы учесть любое изменение Другая.

    Макромолекула будет оказывать влияние на окружающие растворы, привлекая и накапливая одни виды, отталкивая другие. Традиционной отправной точкой для анализа взаимодействия компонентов раствора с макромолекулами является рассмотрение эксперимента по равновесному диализу.Мы рассматриваем для простоты комбинацию только трех видов: водный растворитель w , макромолекула M и малое растворенное вещество s . ( w , M и s иногда обозначаются 1, 2 и 3 соответственно, см. Таблицу). Раствор макромолекул, содержащий N w и N s молекул воды и растворенного вещества на макромолекулу, находится на одной стороне полупроницаемой мембраны. Этот раствор находится в равновесии со стандартным раствором, содержащим молекулы воды и растворенных веществ n w и n s .

    Таблица 1

    s / n w
    Тимашев (12) Парсегян, Рэнд и Рау (1)
    1 или w , вода w , вода
    макромолекула M , макромолекула
    3, сорастворитель с , растворенное вещество
    м x / м w , с

    8 9014 = 3

    x , B 3 N s
    w , B

    8

    1 62 90
    N w
    x — ( м x / м w ) v̄ w или B 3 — ( м 90 061 3 / м 1 ) B 1 N s N w ( n s / n w )
    [ср.уравнения 2 и 3b Тимашева (2)] (ср. уравнения 5a и 6a в настоящей статье)
    δ B 3 N s b N с a = Δ N с ab
    δ B 1 N w b N w a = Δ N w ab

    Затем для препаратов, хранящихся при постоянном давлении p и постоянной температуре T , ограничение Гиббса-Дюгема связывает изменение химического потенциала макромолекул или свободной энергии с изменениями в химическом потенциале растворенного вещества и воды,

    2

    Эталонный раствор имеет собственное ограничение Гиббса-Дюгема,

    3

    , которое требует, чтобы изменения химического потенциала воды и золя Они обязательно связаны:

    4

    Благодаря этой связи μ s ↔ μ w можно наблюдать прямое и косвенное влияние растворенных веществ и воды на макромолекулы.

    В искусстве диализной мембраны часто нет необходимости, если измерения проводятся на препаратах, достаточно разбавленных в макромолекуле, чтобы наблюдаемое поведение не учитывало вклады от взаимодействий между макромолекулами. Затем с полной строгостью мы можем думать о каждой макромолекуле как о растворенном растворе, в котором фактически нет других макромолекул. В этом пределе вода и растворенные вещества находятся в таком избытке, что наличие полупроницаемой мембраны излишне (рис.). Каждую макромолекулу можно рассматривать как находящуюся в равновесии с областями раствора, которые находятся достаточно далеко от макромолекулы, чтобы эти области имели те же свойства, что и эталонный раствор без макромолекул. В этих областях соотношение концентраций растворенного вещества / воды такое же, как и в сконструированном контрольном растворе. Можно представить себе, что каждая гидратированная молекула окружена собственной эффективной мембраной, различающей купающиеся виды (рис.).

    Разбавленные макромолекулы уравновешиваются основным раствором, который содержит соотношение растворенного вещества к воде n s / n w растворенного вещества.В области вокруг макромолекулы отношение растворенного вещества к воде, N s / N w , может отличаться от массы по разным причинам. Если это соотношение отличается между двумя конформациями макромолекулы, обозначенными здесь a и b , то влияние химического потенциала растворенного вещества или воды на равновесие можно описать уравнением. 5 . N s и N w должны рассматриваться как совокупный избыток или дефицит Гиббса (Приложение), т.е.е., как N s / N w отличается от n s / n w .

    Схематическое изображение того, как растворенные вещества могут вызывать осмотический стресс в различных системах в результате их исключения. Растворенное вещество можно стерически исключить из заполненных водой полостей, канавок, каналов или других подобных замкнутых объемов. Точки зрения скученности и предпочтительной гидратации, в частности, касаются исключения растворенных веществ с открытых макромолекулярных поверхностей.

    Можно сместить координаты, поместить отдельную макромолекулу в центр нашего мышления. Теперь мы запишем G s исходя из идеи свободной энергии Гиббса, а не мкс для той части химического потенциала, которая не зависит от концентрации макромолекул. При постоянной, разбавленной концентрации макромолекул изменение свободной энергии все еще описывается уравнением. 2, d μ M = — N w d μ w N s d μ s , но это соотношение экспериментально непрактично без ограничения уравнения .4 так что

    5a

    или

    5b

    N ew — избыточное (или дефицитное) количество вод в окрестностях макромолекулы; N es — избыточное (или недостаточное) количество растворенных веществ. Эти числа полностью аналогичны избытку (или дефициту) поверхности Гиббса, который описывает изменение свободной энергии поверхности при добавлении привлеченных или отталкиваемых растворенных веществ (см. Приложение).

    Изменение химического потенциала растворенного вещества d μ с равно d [ kT ln ( a s )], где a s — активность растворенного вещества, или d μ s = d [ kT ln (γ C s )], где γ — коэффициент активности растворенного вещества, а C s — его концентрация.Аналогично, изменение химического потенциала воды d μ w равно −V̄ w d Π, где V̄ w — молекулярный объем воды, а d Π — дополнительный вклад в осмотическое давление. раствора из добавленного растворенного вещества. Осмотическое давление — это, конечно, коллигативное свойство раствора; это зависит от активности всех компонентов. Однако в наших уравнениях и в эквивалентных уравнениях Тимашева активности всех компонентов, кроме одного растворенного вещества и воды, остаются постоянными.

    Должно быть очевидно, что если большая молекула не влияет на распределение растворенного вещества или воды, то добавленное растворенное вещество не влияет на свободную энергию макромолекулы. Только в той степени, в которой соотношение N s / N w растворенного вещества к воде вблизи макромолекулы отличается от их численного отношения n s / n w в При купании раствора произойдет изменение свободной энергии макромолекулы.Прямое связывание растворенных веществ с макромолекулой означает, что N s / N w > n s / n w ; или наоборот, если макромолекула притягивает воду сильнее, чем растворенное вещество, то N s / N w < n s / n w . Именно здесь Тимашев заявляет о конфликте с законами термодинамики из-за использования им слова инертный.Для нас инертное растворенное вещество — это вещество, которое не действует непосредственно на макромолекулу; нет ни реакции, ни связывания, которые вызывают изменение конформации макромолекулы. Один широкий класс таких инертных молекул — это естественные осмопротекторы, такие как бетаин и глицерин (13, 14). Это конкретное использование инертного является неотъемлемой частью термодинамического использования соотношения Гиббса-Дюгема. § В то же время особенности используемых агентов делают процедуру менее чисто термодинамической.

    Необходимость полупроницаемой мембраны определяется характером эксперимента. Для измерения N ew (или, что эквивалентно, N es ) для отдельных состояний a или b с помощью денситометрии, равновесного центрифугирования или рассеяния света (7, 15), например, требуется использование полупроницаемой мембраны, поскольку соотношения растворенных веществ и воды в эталонных растворах и растворах макромолекул определяются отдельно.Гидростатическое давление, возникающее из-за непроницаемой макромолекулы, будет влиять на распределение растворенного вещества и воды между двумя отсеками. Этот эффект незначителен в пределе разбавленного раствора. Для измерения разницы Δ N ew (или Δ N es ) между двумя состояниями макромолекул не требуется полупроницаемая мембрана, а требуется только метод определения концентрации или отношения вероятностей между двумя состояниями. Перераспределение растворенного вещества и воды вокруг макромолекулы будет влиять на объемную концентрацию растворенного вещества вдали от макромолекулы.Этот эффект также незначителен в пределе разбавленного раствора.

    Поучительные эксперименты — это те, которые включают переключение между аллостерическими состояниями, которые позволяют нам смотреть на различия в вероятностях состояний молекулы (как при открытии / закрытии ионных каналов) или на различия в концентрации (как при оксигенации гемоглобина), когда мы меняем раствор. условия. Если есть две формы макромолекулы a и b , отношение их концентраций (или их вероятностей) выражается в виде экспоненты в разности работы или свободной энергии Δ G ab = G b G a , необходимое для перехода отдельной молекулы между двумя формами, [ b ] / [ a ] = K eq = e (−Δ G ab / кТ ).

    Из уравнения. 5 , у нас

    6a

    или

    6b

    с Δ N ew ab = N ew b N ew a и Δ N es ab = N es b N es a . Наблюдаемое изменение отношения [ b ] / [ a ], следовательно, измеряет разницу в числах N ew или N es для двух состояний.

    Эти два уравнения и уравнения. 5a и 5b строго эквивалентны «фундаментальным уравнениям» 2, 3a и 3b Тимашева (12), потому что его m 3 / m 1 = n s / n w , δv̄ 3 = ( N s b N s a ) = Δ N s ab и δv̄ 1 = ( N w b N w a ) = Δ N w ab (полный перевод символов между двумя наборами уравнений см. В таблице).

    Ур. 6а эквивалентен стандартной изотерме адсорбции Гиббса, обычно используемой для расчета энергетических последствий прямого связывания растворенного вещества. В случаях, когда нет значительной разницы в количестве попутных вод, например, N w a = N w b , тогда, поскольку Δ N es ab = Δ N s ab , уравнение. 6b становится,

    7a

    или

    7b

    Для концентраций растворенных веществ, больших по сравнению с их константой диссоциации от макромолекулы, Δ N es ab является постоянным.Графики Δ G ab от Δμ s , как предписано уравнением. 7a, тогда линейны с наклонами, которые непосредственно дают Δ N s ab = N s b N s a . Применение уравнения. 7b дает нелинейные графики Δ G ab от Δμ w , которые не столь поучительны. В этих случаях различий в прямом связывании растворенного вещества с двумя состояниями макромолекулы имеет смысл использовать уравнение.7а, который связывает различия в химическом потенциале макромолекул с изменениями химического потенциала включенного растворенного вещества.

    В случаях, когда растворенные вещества исключаются нетто ( N s / N w < n s / n w ), коэффициент N ew в уравнении. 5b — это буквально чистое избыточное количество молекул воды, связанных или включенных в макромолекулу. Для макромолекулярной реакции или конформационного изменения из состояния a в состояние b , разностный член в уравнении.6b, Δ N ew ab , — это как раз разница между состояниями a и b в этом избыточном количестве вод, включенных в макромолекулу.

    На языке осмотического стресса уравнение. 6b теперь можно просто записать как изменение разности химических потенциалов между состояниями a и b , Δ G ab , в зависимости от изменения химического потенциала воды или осмотического давления,, и молекулярный объем воды, V ̄ w ,

    8

    В нескольких примерах, упомянутых Тимашевым (12), реакция открытия / закрытия мембранных каналов (3), оксигенация гемоглобина (2), связывание глюкозы гексокиназой (4), BZ-переходом поли (dG-m5dC) (16), оператором связывания репрессора гал-оперона (17), равновесием специфического / неспецифического связывания Eco RI (5), Δ G Было обнаружено, что ab в пределах экспериментальной точности изменяется линейно с осмотическим давлением Π в широком диапазоне концентраций растворенных веществ.Обычно эта линейность включает важный предел [растворенное вещество] → 0. Однако нельзя ожидать, что эта линейность распространится на сколь угодно высокие напряжения. При достаточно высоких концентрациях можно ожидать обмена исключенного растворенного вещества с предпочтительно включенной водой на открытых макромолекулярных поверхностях (18, 19). Кроме того, осмотическое напряжение в конечном итоге деформирует макромолекулу и искажает состояния a и b ; их отдельные N s и N w изменились бы с Π, чтобы дать искаженную оценку Δ N ew ab .

    Линейность Δ G ab относительно Π в этих нескольких случаях означает, что разница в избыточном количестве воды, включенной или связанной с двумя макромолекулярными состояниями, хорошо определена и остается постоянной по мере увеличения концентрации растворенного вещества. Константа Δ N ew ab не означает, что в примерах, перечисленных выше, нет связывания растворенных веществ с макромолекулами, а только то, что нет или очень мало различий в связывании растворенных веществ с двумя состояниями.Любая значительная разница в прямом связывании растворенного вещества с конкретными сайтами в двух макромолекулярных состояниях в дополнение к исключению будет иметь практический эффект, заключающийся в том, что кажущееся значение Δ N ew ab не будет постоянным и будет зависеть от активности растворенного вещества или , что то же самое, по осмотическому давлению. Двойная роль растворенного вещества наиболее четко прослеживается в эффекте хлорид-иона, который имеет как прямое связывание, так и механизмы действия, вызывающие осмотический стресс, на оксигенацию гемоглобина.Эти режимы были индивидуально измерены путем независимого изменения активности воды и активности хлорид-иона с использованием второго растворенного вещества (11).

    Эффекты и причины

    Перспектива осмотического стресса дает поучительно четкую картину причинных эффектов в растворах. Рис. Иллюстрирует две возможности, которые могут вызвать исключение растворенных веществ из макромолекулярного состояния. Макромолекула может иметь карманы или каналы для воды с отверстиями для основного раствора, которые просто слишком малы для проникновения растворенных веществ.Кроме того, растворенные вещества можно исключить с открытых макромолекулярных поверхностей. Перспективы скученности и предпочтительной гидратации были разработаны специально для учета этого последнего вида исключения. Измерения осмотического напряжения с несколькими растворенными веществами разного размера и химической природы, все эффекты которых линейно зависят от их вклада в химический потенциал воды, могут различать различные механизмы. Рис. Иллюстрирует наблюдаемые различия. На фиг. a показана зависимость свободной энергии связывания репрессора Escherichia coli gal с фрагментом ДНК, содержащим его операторную последовательность, от осмотического стресса для двух растворенных веществ, цвиттериона бетаинглицина и сравнительно неполярного триэтиленгликоля.Захоронение открытой поверхности сопровождает связывание свободного белка с ДНК. Фиг. b показывает зависимость изменения свободной энергии от осмотического давления для переноса рестрикционной нуклеазы Eco RI из комплекса с неспецифической ДНК к ее узнавающей последовательности, показанной для тех же двух растворенных веществ. В этой схеме избегается изменение площади поверхности, вызванное связыванием свободного белка. В обеих системах графики являются линейными, что указывает на то, что разница в количестве включенных вод между двумя сторонами реакции является постоянной во всем диапазоне исследуемых концентраций растворенных веществ.Существенная зависимость Δ N ew ab (уравнение 6a) от идентичности растворенного вещества для связывания свободного белка на фиг. a характерна для реакций, сопровождаемых значительными изменениями площади экспонированной поверхности. Соответствующая нечувствительность к идентичности растворенного вещества, наблюдаемая для переноса белка от одной последовательности ДНК к другой на рис. b , характерна для реакций, сопровождаемых доминирующими изменениями в количестве молекул воды, стерически изолированных в карманах или каналах.

    Наблюдаемая зависимость эффекта осмотического стресса от природы растворенного вещества дает представление об основе исключения. ( a ) Изменение энергии связывания репрессора E. coli с ДНК, содержащей его операторную последовательность, при увеличении концентрации растворенного вещества показано как функция осмотического давления растворенного вещества в осмоляльных единицах (данные взяты из ссылка 17). И бетаинглицин (●), и триэтиленгликоль (■), по-видимому, влияют на реакцию через разницу в N ew между свободным белком и ДНК в растворе и в комплексе.Однако разница в воде зависит от растворенного вещества; Δ N ew = 180 вод на комплекс для триэтиленгликоля и 100 для бетаинглицина. Это различие характерно для реакций, закапывающих открытую поверхность. ( b ) Зависимость от осмотического стресса разницы в энергии между специфическим связыванием рестрикционной нуклеазы Eco RI с фрагментом ДНК (ДНК2), который содержит его последовательность распознавания, и неспецифическим связыванием фермента с олигонуклеотидом ДНК ( ДНК1), который не несет последовательности распознавания.Это показано для тех же двух растворенных веществ, бетаинглицина (●) и триэтиленгликоля (■) (данные взяты из ссылки 8). В этом случае действие двух растворенных веществ идентично, в пределах экспериментальной ошибки, с Δ N ew = 110 вод. Этот результат характерен для реакций с изменением количества вод, которые изолированы в стерически недоступных карманах или полостях.

    Стерическое исключение из заполненных водой объемов

    Во многих работах по осмотическому стрессу использовались инертные растворенные вещества для определения изменений размера заполненных водой полостей, канавок, каналов или карманов, которые просто недоступны для растворенных веществ.Это исключение может быть обеспечено диализной мембраной, как это было сделано для реакции гелеобразования серповидного гемоглобина (20). Отличительной особенностью этих систем, например, реакцией открытия / закрытия нескольких каналов (3), оксигенацией гемоглобина (2) и равновесием специфического / неспецифического связывания Eco RI (5), является то, что Δ N ew ab незначительно или, в худшем случае, очень слабо изменяется в зависимости от типа растворенного вещества, используемого для изменения химического потенциала воды.Эти системы наиболее удобны для визуализации осмотического стресса. Опять же, может иметь место прямое связывание растворенного вещества и, скорее всего, исключение из открытых поверхностей, но разница в этом связывании или исключении из открытых поверхностей между двумя состояниями незначительна или отсутствует. Разница в количестве воды между двумя состояниями представляет собой реальный физический объем, который дает прямую информацию о структуре.

    Crowding

    Растворенные вещества часто не могут занимать область у стены или вблизи большой макромолекулярной поверхности.Эффект этого исключения заключается в создании сил истощения, которые сближают области, исключающие растворенные вещества (9). В раствор, содержащий растворенные вещества, выделяется некоторое количество молекул воды, Δ N ew . Эта классическая формула краудинга предполагает, что исключение растворенного вещества является чисто стерическим эффектом. Исключенные объемы рассчитываются на основе взаимодействия твердых сфер. Характерной чертой исключения краудинга является предсказуемая зависимость исключенного объема от размера растворенного вещества, но не от химической природы.Поскольку в рамках этой теоретической основы не рассматривается связывание растворенного вещества, лежащая в основе термодинамика в рамках подхода Гиббса-Дюгема может рассматриваться строго с точки зрения включенной воды. Действительно, в приближении первого порядка, часто используемом в анализе краудинга (например, ссылка 21), в котором пренебрегают взаимодействием растворенного вещества с растворенным веществом, обработка прозрачно дает изменение свободной энергии макромолекул, которое является произведением рассчитанного исключенного объема V̄ w Δ N ew , и приближение первого порядка к осмотическому давлению растворенного вещества (линейное по концентрации растворенного вещества в соответствии с законом Вант-Гоффа идеальных растворов).Расчетный исключенный объем может зависеть от осмотического давления, если включены члены более высокого порядка. Такие вычисления более высокого порядка трудны, потому что включение этих членов для самосогласованности также должно предсказывать осмотическое давление растворенных веществ. Чтобы избежать таких путаниц, в подходе осмотического стресса используются только измеренные осмотические давления.

    Уравнения состояния твердых частиц, которые используются для оценки скученности, могут дать геометрическое представление о космических войнах между молекулами. Для более крупных частиц в коллоидном масштабе силы истощения могут быть точно определены количественно (22).Однако для полимеров, действующих на белки, есть предположения, которые дают только качественную картину твердых сфер. Можно ли смоделировать случайный спиральный полимер как эффективную твердую сферу фиксированного диаметра? Измеренное исключение полиэтиленгликоля с разной молекулярной массой из белков, возможно (23, 24), согласуется с теснотой твердыми сферами (радиусы которых аппроксимируются радиусами вращения полимеров полиэтиленгликоля). Однако измерения с помощью молекулярного счетчика Коултера (25, 26) показывают, что полимеры полиэтиленгликоля разных размеров не всегда исключаются из четко определенных полостей, как того требует модель твердых сфер [e.g., рисунок 4 из Bezrukov et al. (25)]. Скорее, существует широкий диапазон частичного исключения в зависимости от размера молекулы.

    Предпочтительная гидратация

    Химическая природа растворенного вещества, а также его размер могут определять исключение из макромолекулярных поверхностей. Энергия взаимодействия фосфатной группы ДНК, например, с метиленовой группой триэтиленгликоля сильно отличается от энергии взаимодействия с водой. Тимашев (7, 27) сравнил этот механизм исключения растворенного вещества с открытых макромолекулярных поверхностей с увеличением поверхностного натяжения на границах раздела воздух-вода, вызванным полярными растворенными веществами и солями, которые также должны отражать исключение из этой конкретной границы раздела.Аналогия может быть дополнительно расширена путем построения разделяющей поверхности Гиббса для исключения растворенных веществ с открытых поверхностей белка, как это было проницательно сделано для влияния растворенных веществ на поверхностное натяжение воздух-вода (см. Приложение). Аракава и Тимашев (28) измерили зависимость свободных энергий исключения лактозы от площади поверхности белка. Наблюдаемое значение 1,5 кал / моль белка на моль лактозы на 2 Å площади поверхности переводится в эквивалентную разделяющую поверхность Гиббса, которая расположена на ∼ 4 Å от поверхности белка.Как будто на этом расстоянии (примерно один слой воды) не может быть обнаружена лактоза; снаружи будет основная концентрация лактозы. Энергия, необходимая для создания этой эквивалентной зоны, свободной от растворенного вещества, представляет собой работу осмотического давления растворенного вещества, умноженную на очищенный объем.

    Изученные нами макромолекулярные реакции, которые явно включают изменение площади экспонируемой поверхности, как, например, BZ-переход поли (dG-m 5 dC) (16) и связывание свободного E. coli gal. к его операторной последовательности (17), показал, что исключение каждого отдельного растворенного вещества может быть хорошо описано постоянным числом включенных вод, Δ N ew ab , (в диапазоне используемых концентраций растворенного вещества) , но эта разница в избыточном количестве воды между двумя состояниями очень чувствительна как к размеру, так и к химической природе растворенного вещества, исследующего реакцию.

    Перспективы

    Наш интерес к измерению количества воды, вытесняемой в макромолекулярных реакциях, основан на прямом измерении сил между макромолекулами. В этом случае макроскопические конденсированные массивы упорядоченных макромолекул уравновешиваются раствором полимера, который исключен из макромолекулярной фазы (обычно полиэтиленгликоль), и расстояния между макромолекулами измеряются (обычно с помощью рассеяния рентгеновских лучей) как функция осмотического давления полимера.Кривые зависимости термодинамической силы от расстояния были измерены для всех классов биологических макромолекул, липидных бислоев, ДНК, некоторых полисахаридов и белков. Поразительной особенностью этих сил является их сходство для всех очень разных систем, заряженных, нейтральных или полностью незаряженных. Мы интерпретировали эти измерения как указание на то, что макромолекулярные взаимодействия в последние 10–15 Å разделения преобладают за счет структурирования воды между поверхностями (29). Эти силы гидратации намного сильнее на близких расстояниях, чем ван-дер-ваальсовы или электростатические взаимодействия, которые обычно считаются важными.С этой точки зрения ключ к пониманию силы и специфичности, которые характеризуют большинство биологически важных реакций распознавания, находится в воде, которая высвобождается при сопряжении двух взаимодополняющих поверхностей.

    Независимо от того, какую точку зрения предпочитают думать о последствиях исключения растворенного вещества или полимера на реакции между макромолекулярными состояниями или конформациями, индуцированных энергий может быть достаточно, чтобы изменить конформации отдельных состояний. Можно не только измерить изменение исключения растворенного вещества, вызванное закрытием расщелины активного сайта гексокиназы связыванием глюкозы, но также, по-видимому, можно использовать сильное исключение растворенного вещества, чтобы закрыть щель даже в отсутствие глюкозы (4).Теперь можно начать отделить механику открытия и закрытия расщелины от энергетики связывания глюкозы. С помощью подхода осмотического стресса можно не только измерить разницу в секвестрированной воде между дезокси и лигандными конформациями димерного гемоглобина Scapharca , но также и высокие осмотические давления, по-видимому, способные изменить конформацию дезокси-формы на лигандную структуру даже в отсутствие лиганда (30). Не только может быть разница в изолированной воде между комплексами рестрикционной нуклеазы Eco RI, которые специфически и неспецифически связаны с ДНК, но и высокое осмотическое давление может удалить эту изолированную воду из неспецифических комплексов с определенными последовательностями ДНК, которые тесно связаны с ДНК. специфическая связывающая последовательность, но не другие (31).

    Это лишь несколько обнадеживающих примеров того, что можно узнать о макромолекулах, если внимательно посмотреть на их реакцию на активность воды.

    Благодарности

    Мы благодарим Чарльза Андерсона, Сергея Безрукова, Виктора Блумфилда, Дональда Каспара, Брэда Чейреса, Эрнеста Грюнвальда, Джека Корнблатта, Джеймса Ли, Сергея Лейкина, Марию МакГи, Аллана Минтона, Питера Николлса, Чарльза Спинка и Томаса Рекорда за полезное обсуждение или переписка.

    Подсчет количества молекул, адсорбированных на макромолекуле или отталкиваемых от нее

    Среди наиболее сложных концепций физической биохимии — как оценить количество молекул, связанных / притягиваемых или отталкиваемых от макромолекулы.Путаница особенно серьезна, когда происходит скопление или отталкивание небольших молекул около макромолекулы, а не чистое фиксированное связывание.

    Как и во многих термодинамических задачах, проблема была решена и концептуально решена Гиббсом. Рассмотрим изменение энергии поверхности, вызванное добавлением растворенного вещества в раствор, омывающий ее. Изотерма адсорбции Гиббса говорит, что свободная энергия поверхности будет уменьшаться с увеличением химического потенциала растворенного вещества прямо пропорционально плотности Γ растворенных веществ, связанных с поверхностью: dG = -Γ d μ растворенное вещество .Связанный означает избыточное количество молекул растворенного вещества, N es , на поверхности или около нее по сравнению с количеством растворенных веществ, которые могут находиться в том же объеме основного раствора.

    Точно так же отталкивание от поверхности, отрицательное значение N es , означает, что раствор вблизи макромолекул должен быть очищен от растворенных веществ, что требует затрат энергии. Повышенный химический потенциал растворенного вещества в ванне выталкивает растворенное вещество на поверхность и увеличивает стоимость очистки.

    Один из способов визуализировать энергетические затраты на исключение растворенного вещества — это признать, что существует изменение числовой плотности N ( x ) вблизи поверхности, отклонение от объемной плотности, N растворенное вещество (∞) . Если мы рассмотрим бесконечную плоскую поверхность, контактирующую с водным раствором растворенного вещества, связь между изменениями свободной энергии поверхности и изменениями химического потенциала растворенного вещества и воды происходит через это изменение концентрации растворенного вещества,

    A1

    Еще раз, соотношение Гиббса-Дюгема для видов, удаленных от поверхности, N растворенное вещество (∞) d μ растворенное вещество + N растворитель (∞) d μ растворитель = 0, делает это уравнение практическое.Интеграл по удаленной от поверхности области становится равным

    A2

    Свободная энергия поверхности изменяется только в той степени, в которой отношение растворенного вещества к растворителю отличается от соотношения в объеме.

    Макромолекула и притягиваемые / отталкиваемые компоненты ее раствора для купания действуют вместе одинаково. Для растворов, разбавленных макромолекулами, свойства этого раствора пропорциональны концентрации макромолекул. Можно интегрировать избыточное количество [ N i N i (∞)] всех частиц во всем пространстве вокруг каждой макромолекулы в духе изотермы адсорбции Гиббса.

    Двухзонные модели исключения одного растворенного вещества (32) и уравнения. A2 может быть соединен конструкцией разделяющей поверхности Гиббса, которая заменяет фактический профиль растворенного вещества N растворенного вещества ( x ) ступенчатой ​​функцией по концентрации от 0 до N растворенного вещества (∞). Расположение разделяющей поверхности, X Gibbs , фиксировано, чтобы обеспечить такой же поверхностный дефицит растворенного вещества, как и фактический градиент, или ∫ 0 [ N ( x ) — N растворенное вещество ( x )] dx = — N растворенное вещество (∞) X Gibbs .Таким образом, энергия, связанная с созданием этой прозрачной зоны, может рассматриваться как работа, необходимая для выталкивания полупроницаемой мембраны (проницаемой для воды, но не для растворенных веществ) с поверхности с размером x = 0 до x Gibbs . Это смещение вызывает осмотическую работу на единицу площади Π осмотический X Гиббс = кТ N растворенное вещество (∞) X Гиббс , в пределе Вант-Гоффа. Изящным применением этого рассуждения является теория Онзагера-Самараса о повышении поверхностного натяжения при добавлении сильного электролита в раствор (33).По мере того как соль отталкивается от поверхности, для ее создания требуется больше работы.

    Сноски

    § Инертное растворенное вещество в соответствии с определением, наложенным Тимашефф, — это вещество, которое взаимодействует с макромолекулой так же сильно (или так же слабо), как вода: N s / N w = n s / n w . В этом случае уравнения 5а и 5b, растворенное вещество, конечно, не может влиять на химический потенциал макромолекулы.

    Список литературы

    8. Грюнвальд Э. Термодинамика молекулярных частиц. Нью-Йорк: Уайли; 1997. [Google Scholar] 9. Asakura S, Oosawa F. J. Polym Sci. 1958; 33: 183–192. [Google Scholar] 16. Прейслер Р. С., Чен Х. Х., Коломбо М. К., Чоу Й., Шорт Б. Дж., Рау Д. К. Биохимия. 1995; 34: 14400–14407. [PubMed] [Google Scholar] 20. Прути М.С., Шехтер А.Н., Парсегян В.А., J. Mol Biol. 1985; 184: 517–528. [PubMed] [Google Scholar] 22. Динсмор А., Вонг Д. Т., Нельсон П., Йод А. Г. Phys Rev Lett. 1999. 80: 409–412.[Google Scholar] 23. Уиллс П. Р., Георгалис Й., Дейк Дж., Винзор Д. Biophys Chem. 1995; 57: 103–110. [PubMed] [Google Scholar] 25. Безруков С. М., Водяной И., Парсегян В. А. Природа (Лондон) 1994; 370: 279–281. [PubMed] [Google Scholar] 26. Безруков С. М., Водяной И., Брутян Р. А., Касьянович Дж. Макромолекулы. 1996; 29: 8517–8522. [Google Scholar] 29. Лейкин С., Парсегян В. А., Рау Д. К. Annu Rev Phys Chem. 1993; 44: 369–395. [PubMed] [Google Scholar] 32. Рекорд М. Т., младший, Чжан В., Андерсон С. Ф. Adv Protein Chem. 1998. 51: 281–353.[PubMed] [Google Scholar] 33. Ландау Л. Д., Лифшиц Е. М. Статистическая физика, Часть I. 3-е изд. Оксфорд: Пергамон; 1980., разделы 157 и 158. [Google Scholar]

    Осмотическая концепция внутричерепного давления

    Впервые внутричерепное давление (ВЧД) у человека было зарегистрировано в виде пульсирующей кривой Джакомини и Моссо у 37-летней женщины с сифилитической инфекцией в 1876 году [1]. В настоящее время регистрация ВЧД широко используется в нейрохирургии и нейроинтенсивных отделениях.Хотя мониторинг внутрижелудочкового давления является «золотым стандартом», существует несколько косвенных и неинвазивных способов оценки значения внутричерепного давления. Основными альтернативными методами являются: зрительные вызванные потенциалы, фазово-контрастный магнитный резонанс, транскраниальный допплер, смещение барабанной перепонки, внутриглазное давление и акустоупругость.

    Исторически сложилось так, что в 1960-х годах концепция внутричерепного давления Дэвсона была основана на балансе между образованием и абсорбцией спинномозговой жидкости, что привело к простому уравнению:

    ICP = 0.3 x сопротивление + венозное давление. (Формула 1)

    Десять лет спустя расширенные концепции внутричерепной динамики были представлены Мармару и др. . и Avezaat & Eijndhoven [2, 3], что отражено нелинейной зависимостью:

    ICP = P 1 e Vcc / (0,4343 x PVIcc) + P 0 . (Формула 2)

    Несмотря на то, что все более сложные математические модели физики ВЧД позволяют определять ВЧД на основе церебральной гемодинамики, необходимы дополнительные клинические данные для проверки этих методов [4-6].Несмотря на эти многочисленные возможности оценки ценности ВЧД, в научной литературе отсутствуют исследования, касающиеся механизмов, управляющих ВЧД. Поэтому я представляю точную молекулярную концепцию генеза внутричерепного давления.

    Внутричерепной осмотический гомеостаз и осмотический подход к генезу ВЧД: Спинномозговая жидкость плотно окружена полностью непроницаемой паутинной мембраной с внешней стороны и полупроницаемой мембраной, состоящей из глиальных клеток и нейронов с внутренней стороны.Основным катионом спинномозговой жидкости является натрий (Na + ), а основным анионом — хлорид (Cl ). Следующие ионы присутствуют в спинномозговой жидкости, но в гораздо более низких концентрациях: HCO 3 , Ca 2+ . Остальные органические и неорганические ионы не включаются в дальнейший анализ из-за значительно более низких концентраций. Между внутриклеточными и внеклеточными ионами существует динамическое равновесие, определяющее химический градиент между обоими компартментами.И эта разница в давлении двух отсеков и есть осмотическое давление (ΔΠ ) растворенных веществ. Пассивное распределение воды через биологическую полупроницаемую мембрану является термодинамическим следствием распределения растворенных веществ. В закрытом и жестком черепе изменение объема отсека приведет к перепаду давления. При динамическом равновесии между компартментами осмоляльность жидкости внутри клетки и в спинномозговой жидкости одинакова, хотя концентрация каждого иона неодинакова.Оба отсека находятся в стационарном осмотическом состоянии. Поток воды через мембрану мог быть остановлен эквивалентным гидростатическим давлением объема воды. Это давление блокировки и есть осмотическое давление.

    Осмотическое давление выражается классическим уравнением Вант-Гоффа [7]

    ΔP = ΔΠ = R x T x ΔC, (Формула 3)

    где ΔP — разность гидростатического давления, R — постоянная идеального газа (8.31 Дж / моль x K), T — температура тела в градусах Кельвина (37 ° C = 310,15 ° K), ΔC — разница молярных концентраций растворенных веществ.

    Таким образом, осмотический градиент между внутренней и внешней средой глиальных / нейрональных клеток представляет собой разницу между наиболее заметными ионами спинномозговой жидкости и их содержанием внутри клеток.

    Расчет осмотического давления спинномозговой жидкости: Для оценки осмотического давления между спинномозговой жидкостью и глиальной / нейрональной цитоплазмой используется приведенная выше формула 3.Градиент концентрации растворенного вещества ΔC (разница между выбранной химической концентрацией наиболее распространенных ионов на глиальной и нейрональной полупроницаемой мембране) показан в таблице 1. Концентрации ионов в головном мозге были установлены на основе опубликованных данных [8-11].

    Таким образом, градиент концентрации растворенного вещества в спинномозговой жидкости по сравнению с астроцитами и нейронами составляет 249,42 мМ и 270,15 мМ соответственно. Поскольку соотношение глии к нейрону в головном мозге человека составляет 1: 1, оба эти отдела необходимо учитывать при расчете общего осмотического давления спинномозговой жидкости [12].Поэтому при расчете общего градиента используется следующая формула

    ΔC = ½ ΔC CSF / Glial + ½ ΔC CSF / Neuron , (Формула 4)

    , откуда получаем ΔC = 259,785 мМ.

    Таким образом, общее осмотическое давление спинномозговой жидкости, используя Формулу 3, составляет 669.56 Па.

    Гидростатическое давление спинномозговой жидкости составляет 6,8 см H 2 O (5,02 мм рт. Ст.).

    Макроскопических исследований недостаточно для точного определения внутричерепного гомеостаза. Проблема трансмембранного проникновения жидкостей требует изучения на атомарном уровне. Необходимо провести дальнейший анализ диффузии через границу такого количества внутричерепных компартментов. Также существует электрохимический потенциал композиций, который является важной движущей силой движения ионов и биомолекул, требующей определения его роли в создании внутричерепного давления.

    Внутричерепное давление можно определить как давление спинномозговой жидкости, заключенной в черепе и позвоночнике. Давление спинномозговой жидкости действует на непроницаемую паутинную мембрану с внешней стороны и на глиальную / нейрональную полупроницаемую мембрану с внутренней стороны. Согласно термодинамическим принципам, осмотическое давление между спинномозговой жидкостью и цитоплазмой астроцитов / нейронов через глиальную / нейрональную мембрану является движущей силой гидростатического давления в компартменте спинномозговой жидкости.И это гидростатическое давление и есть внутричерепное давление. В нормальных условиях — трансмембранное равновесие — значение внутричерепного давления составляет около 7 см H 2 О. Осмотический подход представляет собой первую такую ​​попытку описать происхождение ВЧД.

    Вклад автора: концепция и дизайн исследования, сбор и сбор данных, анализ и интерпретация данных, написание статьи, критическая доработка статьи, утверждение статьи.

    Автор заявляет, что у него нет конфликта интересов.

    Автор благодарит Патрицу Хербовскую-Титро за помощь в переводе на английский язык и окончательную подготовку статьи с точки зрения лексики и грамматики.

    Финансирование получено не было.

    Автор заявляет, что у него нет конкурирующих интересов.

    1. Giacomini C, Mosso A (1876) Esperienze sui movimenti del cervello nell’uomo. Arch Sci Med 1: 245-278.
    2. Marmarou A, Shulman K, LaMorgese J (1975) Компартментальный анализ соответствия и сопротивления оттоку системы спинномозговой жидкости. J Neurosurg 43: 523-534. [Crossref]
    3. Avezaat CJ, van Eijndhoven JH (1986) Клинические наблюдения за взаимосвязью между пульсовым давлением спинномозговой жидкости и внутричерепным давлением. Acta Neurochir (Вена) 79: 13-29
    4. Ursino M, Lodi CA (1997) Простая математическая модель взаимодействия между внутричерепным давлением и церебральной гемодинамикой. J Appl Physiol 82: 1256-1269. [Crossref]
    5. Wang JX, Hu X, Shadden SC (2019) Моделирование внутричерепного давления с дополнением данных. Энн Биомед Анг 47: 714-730.
    6. Wagshul ME, Eide PK, Madsen JR (2011) Пульсирующий мозг: обзор экспериментальных и клинических исследований внутричерепной пульсации. Барьеры для жидкостей CNS 8: 5.
    7. Evans DH (2008) Осмотическая и ионная регуляция: клетки и животные. CRC Press.
    8. Somjen GG (2004) Ионы в мозге. Нормальная функция, судороги и инсульт. Издательство Оксфордского университета.
    9. Rose CR, Verkhratsky A (2016) Принципы гомеостаза натрия и передачи сигналов натрия в астроглии. Glia 64: 1611-1627.
    10. Hajjawi OS (2014) Биохимия человеческого мозга. Американский журнал бионауки 2: 122-134.
    11. Ирани Д. Н. (2008) Цереброспинальная жидкость в клинической практике. Elsevier Health Sciences.
    12. Von Bartheld CS, Bahney J, Herculano-Houzel S (2016) Поиск истинного количества нейронов и глиальных клеток в человеческом мозге: обзор подсчета клеток за 150 лет. Дж. Comp Neurol 524: 3865-3895.[Crossref]

    Границы | Коллапс осмотических везикул герметичных мембранных везикул изнутри-наружу из красных кровяных телец

    Введение

    Оригинальный метод создания пузырьков наизнанку (IOV) из плазматических мембран эритроцитов (RBC) был разработан Steck et al. (1970) и Штек и Кант (1974). Первым шагом был лизинг эритроцитов в больших объемах среды с низкой осмолярностью и низкой ионной силой, не содержащей двухвалентных катионов, слегка забуференных до pH 7.5–7,8. Было показано, что дальнейшие длительные промывания и инкубации клеточных мембран в этой среде при низкой температуре вызывают разборку лежащего в их основе кортикального цитоскелета, в результате чего обнаженные мембраны легко образуются пузырьками под действием сильных сдвигающих сил.

    В IOVs, генерируемых методом Steck-Kant, активность канала K + , активированного Ca 2+ (канал Gardos), как сообщается, отсутствует или инактивирована (Sarkadi et al., 1980). В поисках стадии, на которой активность канала могла быть потеряна, мы обнаружили, что инкубация мембран из недавно лизированных клеток при 37 ° C в среде для лизиса Steck-Kant вызвала быструю и спонтанных изнутри-наружу везикуляцию во время разборки цитоскелета (Lew et al. ., 1982; Лью и др., 1988; Тифферт и Лью, 2014). Мы назвали везикулы, полученные с помощью этого быстрого метода, «одноэтапным IOV». Это открытие позволило нам проследить мембранные изменения во время спонтанной везикуляции в организованных образцах, что привело к выяснению динамической морфологии процесса и механизма везикуляции (Lew et al., 1988; Tiffert and Lew, 2014).

    Везикулы, полученные «одностадийным» методом, демонстрируют замечательную гетерогенность одиночных, двойных или тройных концентрических везикул (Lew et al., 1988), что также показано на электронной микрофотографии на Фигуре 1A. Функциональные исследования документально подтвердили, что одностадийные везикулы сохраняли активность Na / K-насоса, кальциевого насоса плазматической мембраны, канала Гардоса и анионообменника, т. Е. Основного переносчика ионов в мембране эритроцитов (Garcia-Sancho et al., 1982 ; Лью и др., 1982; Альварес и Гарсия-Санчо, 1987; Гарсия-Санчо и Альварес, 1989).

    Рис. 1. Электронные микрофотографии (ЭМ) преимущественно вывернутых наизнанку везикул, полученные одностадийным методом (Lew et al., 1982; Гарсия-Санчо и Альварес, 1989 г.). (A) Аликвоты суспензии везикул после инкубации в среде для лизиса A при 37 ° C обрабатывали и дополнительно обрабатывали для ЭМ, как описано в разделе «Материалы и методы». (B – D) Везикулы в аликвотах суспензии, описанной для панели A, центрифугировали, промывали и ресуспендировали в среде B, обрабатывали для ЭМ и наблюдали при увеличении увеличения в (C, D) .

    Однако о влиянии гипертонических переходов, необходимых для функциональных исследований, на морфологию одноступенчатых IOV ранее никогда не сообщалось.Это предмет текущего расследования.

    Материалы и методы

    Протокол приготовления одноэтапных везикул, использованный в этом исследовании, был подробно описан ранее (Garcia-Sancho et al., 1982; Lew et al., 1982; Garcia-Sancho and Alvarez, 1989) и кратко изложен в исследование Тифферт и Лью (2014; рис. 1). Состав гипотонической среды, в которой лизировались эритроциты и образовывались везикулы (среда A), был (в мМ): HEPES-Na (pH 7.5) 2,5 и EGTA 0,1. Состав среды, использовавшейся в прошлом для транспортных исследований (среда B) (Lew et al., 1982; Garcia-Sancho and Alvarez, 1989), которая была применена здесь для ресуспендирования свежеприготовленных везикул для исследования морфологических эффектов гипертонический переход был (в мМ): NaCl, 50; KCl, 10; Na-HEPES (pH 7,5), 25; MgCl 2 1,5; EGTA, 0,02.

    Подготовка образцов для электронной микроскопии (ЭМ)

    Сразу после инкубации в среде для лизиса A при 37 ° C аликвоты суспензии везикул переносили в 1.Микроцентрифужные пробирки объемом 5 мл и центрифугирование 10 000 × г в течение 1 мин. Слабо гранулированные везикулы были постфиксированы в 1% OsO 4 и обработаны, как сообщалось ранее (Lew et al., 1985; Lew et al., 1988). Для тестирования эффектов гипертонуса везикулы в некоторых аликвотах ресуспендировали в среде B и инкубировали в течение 10–30 мин при 37 ° C. После инкубации везикулы вращали при 10000 × г в течение 1 мин в их исходных микроцентрифужных пробирках, а затем гранулы фиксировали в 1% OsO 4 и обрабатывали аналогично образцам в среде А.

    Результаты

    На рис. 1А показаны свежеобразованные везикулы в гипотонической среде А со смесью одинарных, двойных и тройных концентрических везикул, типичных для этого препарата (Lew et al., 1988).

    На рис. 1В показано изменение внешнего вида, вызванное суспендированием свежеобразованных везикул в среде B. Мембраны везикул четко разделены на две отдельные популяции с тонкими или толстыми контурами мембран. Некоторые из толстых мембранных пузырьков образуют форму наушников.

    Когда везикулы, суспендированные в среде B (рис. 1B), промываются и снова суспендируются в среде A, их внешний вид меняется, как показано на рис. 1A. Это была единственная процедура, способная обратить вспять эффекты гипертонического воздействия.

    При большем увеличении можно увидеть, что контуры толстой мембраны на рисунке 1B являются результатом плотного прилегания двойных мембран (рисунки 1C, D, 2, 3). Рисунок 1D предлагает прямое сравнение контуров тонкой и толстой мембраны. Конфигурация наушников в сочетании с близким расположением двух мембран напоминает форму полностью спущенного шара или двойной чашки, как видно в продольном разрезе.Это демонстрирует трехмерную (3D) чашеобразную форму везикул с двойной мембраной за их внешним видом в наушниках в продольных сечениях. Предполагается, что поперечные сечения будут отображать толстые круглые изображения, как показано на рисунке 1C. На рисунках 2, 3 показано, как интернализованные мембраны исходных двойных и тройных концентрических пузырьков смещаются к толстому краю чашечек.

    Рисунок 2. Образцы формы наушников. Просвечивающая электронная микрофотография выбранных спавшихся везикул, показывающая близкое расположение мембран, свободных от цитоскелета, очерчивающая формы «наушников» в продольных срезах.Обратите внимание на массивное сокращение внутрипузырного пространства, очертания трехмерной чашеобразной формы спавшихся пузырьков и смещение содержимого к краю чаши. 67,500x.

    Рис. 3. Деталь обода чашки и двойных мембран. Просвечивающая электронная микрофотография, показывающая детали близости мембран в спавшихся пузырьках и небольшого внутреннего пузырька со сжатой двойной мембраной, смещенной к краю более крупного везикулы хозяина, формируя выпуклость края в этой точке.175,000x.

    Обсуждение

    Результаты на Рисунке 1 показывают, что в гетерогенных популяциях пузырьков плазматической мембраны из эритроцитов человека значительная часть везикул испытывает резкий коллапс объема при переносе в среду с повышенной осмолярностью (Рисунки 1B – D, 2). Только запечатанные везикулы с сохраненной водопроницаемостью и ограниченной проницаемостью растворенных веществ могут испытывать такой коллапс под действием осмотических градиентов. Следовательно, гетерогенный морфологический ответ на гипертонические переходы разделяет везикулы по их герметичному состоянию.

    RBC мембраны без цитоскелета, как было показано, ведут себя как двумерная жидкость, лишенная внутреннего контроля формы (Tiffert and Lew, 2014). Кривизна по краю коллапсированных везикул чашеобразной формы, образец которой более подробно показан на рисунке 3, определяется комбинацией собственного модуля изгиба свободной мембраны (Evans, 1983), взаимодействия белков мембраны на кривизна мембраны (Reynwar et al., 2007) и выпуклость, создаваемая внутренними пузырьками, смещенными к краю во время коллапса объема везикулы хозяина.Оглядываясь назад, можно сказать, что случайные микроскопические наблюдения везикул с «более острыми границами» в среде B были отмечены во время прошлых функциональных исследований (Lew et al., 1982), но не были интерпретированы вовремя. Это открывает возможность оценки доли схлопнувшихся везикул на основе микроскопических наблюдений или измерений светорассеяния.

    Рисунки 1C, D, 2 показывают, что состояние субпопуляций запечатанных везикул во время транспортных экспериментов является состоянием значительно уменьшенного внутрипузырного объема и значительного увеличения отношения площадь / объем по сравнению с их первоначальным сферическим состоянием.Константы скорости, используемые для оценки проницаемости мембран в везикулах, сильно зависят от их соотношения площадь / объем. Поэтому важно знать об осмотическом коллапсе запечатанных пузырьков, подверженных обычным гиперосмотическим переходам, применяемым в функциональных исследованиях для правильной интерпретации кинетических данных (Lew et al., 1983; Alvarez et al., 1988).

    Заявление о доступности данных

    Оригинальные материалы, представленные в исследовании, включены в статью / дополнительные материалы, дальнейшие запросы можно направлять соответствующим авторам.

    Авторские взносы

    Оба автора внесли одинаковый вклад во все аспекты этого исследования.

    Финансирование

    Эта работа была поддержана The Wellcome Trust, Великобритания (Ref .: 15543 / 1.5).

    Конфликт интересов

    Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Примечание издателя

    Все утверждения, выраженные в этой статье, принадлежат исключительно авторам и не обязательно отражают претензии их дочерних организаций или издателей, редакторов и рецензентов.Любой продукт, который может быть оценен в этой статье, или заявление, которое может быть сделано его производителем, не подлежат гарантии или одобрению со стороны издателя.

    Благодарности

    Мы благодарны Остину Хокэдею за отличную техническую помощь с ЭМ изображениями.

    Список литературы

    Альварес Дж. И Гарсиа-Санчо Дж. (1987). Оценка количества Ca 2+ -зависимых каналов K + в эритроцитах человека. Biochim. Биофиз. Acta 903, 543–546.DOI: 10.1016 / 0005-2736 (87) -9

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Альварес Дж., Гарсия-Санчо Дж. И Эррерос Б. (1988). Все или никакие клеточные ответы Ca2 + -зависимых K-каналов, вызванные кальцием или свинцом в красных клетках человека, можно объяснить неоднородностью распределения агонистов. J. Membr. Биол. 104, 129–138. DOI: 10.1007 / bf01870925

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Эванс, Э. А. (1983). Модуль упругости при изгибе мембраны эритроцитов, полученный из-за нестабильности изгиба в тестах на аспирацию микропипеткой. Biophys. J. 43, 27–30. DOI: 10.1016 / S0006-3495 (83) 84319-7

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Гарсия-Санчо Дж. И Альварес Дж. (1989). Приготовление и свойства одноэтапных везикул из мембран красных клеток, вывернутых наизнанку. Methods Enzymol. 173, 368–377. DOI: 10.1016 / s0076-6879 (89) 73024-x

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Лью В. Л., Хокадей А., Фриман К. Дж. И Букчин Р. М. (1988). Механизм спонтанной везикуляции наизнанку мембран эритроцитов. J. Cell Biol. 106, 1893–1901. DOI: 10.1083 / jcb.106.6.1893

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Лью, В. Л., Хокадей, А., Сепульведа, М. И., Сомлио, А. П., Сомлио, А. В., Ортис, О. Е. и др. (1985). Компартментализация серповидноклеточного кальция в вывернутых наизнанку везикулах эндоцитов. Природа 315, 586–589. DOI: 10.1038 / 315586a0

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Лью, В. Л., Муаллем, С.и Сеймур К.А. (1982). Свойства активированного Ca 2+ канала K + в одностадийных вывернутых наизнанку везикулах из мембран эритроцитов человека. Природа 296, 742–744. DOI: 10.1038 / 296742a0

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Лью, В. Л., Муаллем, С., и Сеймур, К. А. (1983). Ca-активированный K-канал эритроцитов человека: полностью или полностью отсутствует механизм открытия Ca 2+ . Cell Calcium 4, 511–517.DOI: 10.1016 / 0143-4160 (83) -x

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Рейнвар Б. Дж., Илья Г., Хармандарис В. А., Мюллер М. М., Кремер К. и Дезерно М. (2007). Агрегация и везикуляция мембранных белков посредством взаимодействий, опосредованных кривизной. Природа 447, 461–464. DOI: 10.1038 / nature05840

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Саркади Б., Себени Дж. И Гардос Г. (1980). «Влияние кальция на процессы транспорта катионов в вывернутых наизнанку везикулах мембран эритроцитов», в Membrane Transport in Erythrocytes.Отношения между функцией и структурой. Симпозиум Альфреда Бензона 14 , ред. У. В. Лассен, Х. Х. Уссинг и Дж. О. Уит (Копенгаген: Мюнксгаард).

    Google Scholar

    Штек, Т. Л., и Кант, Дж. А. (1974). Получение непроницаемых призраков и вывернутых наизнанку везикул из мембран эритроцитов человека. Methods Enzymol. 31, 172–180. DOI: 10.1016 / 0076-6879 (74) 31019-1

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Штек, Т. Л., Вайнштейн, Р. С., Штраус, Дж. Х., и Уоллах, Д. Ф. Х. (1970). Везикулы мембран эритроцитов наизнанку: подготовка и очистка. Наука 168, 255–257. DOI: 10.1126 / science.168.3928.255

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Тифферт Т., Лью В. Л. (2014). Динамическая морфология и изменения белка цитоскелета во время спонтанной везикуляции наизнанку мембран эритроцитов. Pflugers Arch. 466, 2279–2288. DOI: 10.1007 / s00424-014-1483-5

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    молекул | Бесплатный полнотекстовый | Эффективность осмотической дегидратации яблок в растворах полиолов

    2.1. Содержание воды (WC)
    Значения WC уменьшались с продлением процесса обезвоживания. В таблице 1 и таблице 2 показаны изменения WC во время экспериментов. Сырье характеризовалось WC 7,31 ± 0,01 г / г сухого вещества. Во всех случаях увеличение концентрации осмотического раствора приводило к большей степени обезвоживания яблок. Наивысшая степень обезвоживания была достигнута при использовании 40% раствора ксилита, а концентрация эритрита-WC была снижена примерно до 1.60 г / г д.м .; следовательно, эти альтернативные решения более эффективны по сравнению с концентрацией 50% раствора сахарозы. 40% -ный раствор мальтита и 30% -ный раствор эритритола показали эффективность, аналогичную эффективности сахарозы. Использование растворов, содержащих инулин и олигофруктозу, а также 20% раствора мальтита оказалось неэффективным. Несмотря на то, что статистический анализ показал влияние типа осмотического агента (таблица 3), односторонний дисперсионный анализ не показал какого-либо значительного влияния времени или концентрации на значения WC при использовании растворов инулина и олигофруктозы.Более высокий осмотический эффект, отмеченный для растворов ксилита и эритрита, по сравнению с сахарозой, был приписан более высокой (почти двойной) молекулярной массе сахарозы и, как следствие, более низкому осмотическому давлению по сравнению с альтернативными растворами. В недавнем исследовании Rodriguez et al. [22] дегидратированные нектарины в течение 2 часов (с исходным WC 4,602 г / г дм3) в 60% растворе сорбита для достижения снижения WC до значения 1,903 ± 0,779 г / г дм, тогда как 40% % концентрация раствора глюкозы приводила к плохому снижению значений WC.Более того, когда использовались глюкоза и сорбит (2,52 г / г дм3 и 2,59 г / г дм соответственно), полученные значения были аналогичны результатам настоящего исследования, в котором использовались те же условия: продолжительность 2 часа с 40 % концентрации раствора ксилита и мальтита (таблица 1). Brochier et al. [15] дегидратированный якон в 33% -ной концентрации растворов, альтернативных сахарозе, а именно мальтодекстрина, полидекстрозы, сорбита и глицерина, в течение 30, 60, 120, 240 и 360 мин. Их результаты подтвердили, что во время процесса наблюдалось уменьшение WC.Наилучшие результаты были достигнуты при использовании глицерина и сорбита. В их исследовании мальтодекстрин не вел себя как осмотический агент.
    2.2. Потеря воды (WL)

    WL — важный параметр массопереноса, который указывает на эффективность OD. Чтобы оценить приемлемость использования альтернативных растворов, кривые кинетики OD в 50% растворе сахарозы были нанесены на фигуры (показаны ниже пунктирными линиями).

    Нелинейное увеличение WL наблюдалось при всех концентрациях в процессе OD.Во всех случаях, за исключением растворов с олигофруктозой, инулином и мальтитом, при концентрациях 20% наблюдалась начальная высокая скорость массопереноса с последующим ее уменьшением (рис. 1). Это указывает на то, что система приближалась к концу осмотического процесса (т.е. к псевдоравновесию) [10]. Это явление было наиболее выражено в течение первых трех часов процесса. В этом исследовании предварительная осмотическая обработка в течение более 3 часов была неэффективной. Эта взаимосвязь была лучше всего продемонстрирована в случае растворов эритрита (рис. 1а) и ксилита (рис. 1б).Это говорит о том, что необязательно обезвоживать ломтики яблока в растворах более 3 часов. Статистический анализ также подтвердил это утверждение — значения, полученные через 180 минут или дольше, были отнесены к одной однородной группе (Таблица 5). [15] наблюдали, что изменение содержания влаги больше не было значительным через один час при использовании глицерина, сорбита или полидекстрозы. В исследовании Moreira et al. Сообщалось о высоком уровне WL в начале процесса.[20] во время OD каштана, а также в исследованиях Khan et al. [23] во время OD яблок. Это связано с разницей осмотического давления между осмотическим раствором и пищей. Впоследствии это явление уменьшается, потому что градиент концентрации между раствором и пищей со временем уменьшается [2]. Риццоло и др. [24] обезвоживание ломтиков клубники в 60% концентрированных растворах сахарозы и сорбита в течение 6 ч при температуре 30 ° C. Они заметили, что WL постоянно увеличивался в течение обоих процессов.Более высокие значения были получены при использовании раствора сорбита. Это связано с разной молекулярной массой сорбита (182,18 г / моль) и сахарозы (342,30 г / моль), которые при одинаковых концентрациях дают разную активность воды (0,87 и 0,93 соответственно). В этом исследовании OD в 40% растворе эритрита и ксилита была более эффективной по сравнению с процессом дегидратации в растворе сахарозы (рис. 1a, b). Это также можно объяснить более низкой молекулярной массой эритрита и ксилита (122.12 г / моль и 152,15 г / моль соответственно). Увеличение концентрации раствора привело к увеличению градиентов осмотического давления и, следовательно, к более высокому WL во всех случаях (кроме растворов, содержащих инулин и олигофруктозу) (рис. 1d, e). Аналогичные результаты были получены Khan et al. [23] в OD яблок в концентрациях раствора от 40% до 60%, а также Djendoubi et al. [25], которые проводили OD-процесс груш в растворе сахарозы (от 25 до 65 o Brix). Это объясняется увеличением осмотической движущей силы между образцом и окружающим раствором.Повышение температуры снижает вязкость осмотического раствора и сопротивление массопереносу между поверхностью и осмотическим раствором, тем самым облегчая отток воды из образца и скорость диффузии растворенного вещества в образец [2]. Влияние температуры на OD было подтверждено Devic et al. [26], в OD яблок при температурах 45 ° C и 60 ° C. В этом исследовании все концентрации (от 20% до 40%) растворов мальтита были менее эффективны по сравнению с сахарозой в качестве растворенного вещества (рис. 1c). ).Более высокая концентрация мальтита (50%) привела к более высоким значениям WL и твердого прироста (SG) по сравнению с сахарозой [27]. В нескольких исследованиях уравнение Пелега часто использовалось для моделирования кинетики WL и поглощения растворенных веществ во время OD [10,28,29]. Чтобы оценить степень соответствия моделей в различных растворах, значения параметров моделирования WL с использованием модели Пелега показаны в таблице 4. Использование моделирования OD по Пелегу было эффективным при всех концентрациях растворов эритрита и ксилита — качество fit имеет высокие значения R 2 и низкие значения RMSE и χ 2 (Таблица 4).В случае других решений моделирование WL с использованием модели Пелега было эффективным только при 40% -ных концентрациях — в других случаях значения параметра CRV были более 20%, что указывает на то, что модель не может использоваться для прогнозирования WL. K 1 относится к скорости обезвоживания в самом начале процесса. Величина, обратная k 1 , описывает начальную скорость массообмена (т.е. чем ниже k 1 , тем выше скорость массообмена) [10]. Из данных таблицы 4 видно, что при постоянной температуре k 1 уменьшалась с увеличением концентрации раствора с 20% до 40%, что свидетельствует об увеличении начальной скорости массообменных условий (наибольшее значение наблюдалось в 40% растворе ксилита).Было показано [30], что параметр k 2 определяет равновесное содержание влаги (и растворимых твердых веществ) — значение, которое, как ожидается, будет изменяться в зависимости от концентрации сиропа. Эти результаты неудивительны. Чем ниже параметр k 2 , тем выше удаление воды; достигнутые значения WL в OD с использованием растворов эритрита и ксилита были более эффективными при более высоких концентрациях (Рисунок 1a, b). OD в инулине и олигофруктозе был неэффективным — наблюдаемые значения WL были низкими (Рисунок 1d, e), а значения параметра k 2 в уравнении Пелега были высокими (таблица 4).Статистический анализ разделил эти значения сначала на две однородные группы — с самыми низкими значениями (Таблица 5). Такое поведение было связано с высокой молекулярной массой этих веществ, что приводит к низкой движущей силе процесса, в то время как изменения гидродинамических характеристик внешней фазы модифицируют глобальное сопротивление массопереносу. Оценка альтернатив сахарозным веществам (олигофруктоза, мальтитол и олигофруктоза / трегалоза) была проведена в исследовании Giannakourou и Taoukis [19].Их результаты показывают, что наибольшая WL во время OD была у мальтита, который имел наименьшую молекулярную массу, хотя эффект альтернативных осмотических агентов был незначительным. Mendonça et al. [31] наблюдали, что WL в значительной степени зависела от продолжительности предварительной обработки ультразвуком в линейном выражении для растворов ксилита и сорбита. Также сообщалось, что в конце обработок WL был более выражен в образцах, обработанных растворами сорбита, эритрита и ксилита [29]. Более низкие значения были получены в образцах, обработанных растворами изомальта и мальтита, которые являются осмотическими агентами с более низкой молекулярной массой.
    2.3. Solid Gain (SG)
    Основным явлением в процессе OD является потеря воды. Удельная плотность материала в материале была незначительной, с максимальными значениями приблизительно 1 г / г внутр. Д.м. при использовании концентраций 40% растворов ксилита, эритрита и мальтита, а также концентраций 30% растворов ксилита и эритрита в течение от 4 до 6 часов (рис. 2a – c). Mendonça et al. [29] наблюдали аналогичную ситуацию в конце процесса; Наибольшая удельная плотность корней якона была получена при использовании раствора эритрита.Концентрация раствора оказала значительное влияние на SG во время процесса (таблица 7). Как и в случае с параметрами, обсужденными выше, сообщалось о большей эффективности, чем сахароза, при использовании 30 и 40% растворов эритрита и ксилита, а также 40% раствора мальтита (рис. 2a – c). Достигнутые значения были отнесены к одной однородной группе. SG в яблоках на том же уровне, что и при использовании сахарозы, также была достигнута в процессе OD более 3 часов в 30 и 40% растворах инулина (рис. 2d).В случае OD в олигофруктозе увеличение сухого вещества в плодах было незначительным (рис. 2e), что было связано с высокой молекулярной массой этого соединения. Чем ниже SG, тем лучше сохраняются исходные характеристики пищи [32]. Поэтому желательны небольшие значения SG, связанные с высокой скоростью WL. Brochier et al. [15] сообщили SG, когда они использовали растворы сорбита, глицерина и полидекстрозы, хотя они не наблюдали увеличения содержания сухого вещества при использовании мальтодекстрина.Наибольшие значения SG были достигнуты в случае первых двух растворов, а именно сорбита и глицерина. Это объяснялось их более низкой молекулярной массой по сравнению с мальтодекстрином, что привело к более высокому осмотическому давлению и более легкому проникновению в ткань яблока. Более того, они также указали, что увеличение содержания сухого вещества произошло в основном в течение первых двух часов процесса. Это согласуется с результатами, полученными в текущих исследованиях, в основном с 30 и 40% растворами эритрита.Значения k 1 , k 2 , R 2 , χ 2 , CRV и RMSE моделирования SG с использованием модели Пелега показаны в таблице 6. Согласно данным в таблице 6, k 1 для всех кинетических условий массоперенос уменьшался с увеличением концентрации осмотического раствора при постоянной температуре раствора. Высокие значения параметра k 1 указывают на низкую скорость массопереноса. Параметр k 2 определяет равновесное содержание влаги и растворимых твердых веществ — достигнутые значения были выше по сравнению с моделированием WL с использованием модели Пелега (т. Е.е. эффект удаления воды был меньше). Оценка качества соответствия SG с использованием модели Пелега отличалась от моделирования параметров WL. Использование модели OD по Пелегу было эффективным при всех концентрациях только в случае раствора эритрита. Эту модель также можно использовать для прогнозирования SG при концентрациях 20% и 30% с использованием ксилита и инулина, но не при самых высоких концентрациях. В случаях 20% мальтита и 30% олигофруктозы значения параметра CRV были более 20%, что указывает на то, что модель не может использоваться для моделирования SG во время OD.Значения SG, полученные Mendonça et al. [31] после OD клубней якона в 40% растворе ксилита были примерно в два раза выше, чем в тех же условиях в 40% растворе сорбита. В более позднем исследовании Mendonça et al. [29] скорость SG снижалась после первого часа осмотической обработки в 40% растворах ксилита, мальтита, эритрита, изомальта и сорбита. В статистическом ANOVA наблюдалось значительное влияние времени на SG (таблица 7). Противоположная ситуация наблюдалась Fasogbon et al.[33]; Согласно их исследованиям, поглощение твердого вещества во время OD ананаса в растворе сахара не претерпело значительных изменений с течением времени, но наиболее значительные изменения в растворе сахара / соли произошли в первые 3 часа процесса OD. Taiwo et al. [34] также сообщили об оптимальной удельной концентрации половинок клубники через 3 часа.
    2.4. Активность воды (a
    w ) Прямая связь между увеличением концентрации раствора и снижением уровня активности воды наблюдалась в основном в случае OD с использованием ксилита (рис. 3b).Эта взаимосвязь не наблюдалась при использовании растворов мальтита, инулина и олигофруктозы (рис. 3c – e). Статистически значимое влияние (α = 0,05) w наблюдалось всех факторов: типа осмотического агента, концентрации раствора и времени (таблица 8). Значительное уменьшение значений для w наблюдалось в основном в конце процесса OD. Более высокие концентрации осмотических растворов приводили к более низким значениям этого параметра. Самые низкие средние значения были получены для эритрита (примерно 0.928) и ксилит (0,942). Это видно на гистограммах, которые находятся под линейной диаграммой, относящейся к a w яблока, обезвоженного в 50% растворе сахарозы (рис. 3a, b). Значения w во время OD в растворах мальтита, инулина и олигофруктозы были отнесены к одной гомогенной группе, что означает, что влияние этих типов осмотических растворов на снижение w было незначительным (Таблица 8) . Более высокие значения w , достигнутые с мальтитом, инулином и олигофруктозой, были связаны с небольшим WL по сравнению с сахарозой, как обсуждалось выше.В OD клубней якона Mendonça et al. [31] использовали 40% раствор ксилита и сорбита и сообщили о несколько более высоких значениях для w после OD (0,971 и 0,975, соответственно). Влияние концентрации раствора на w было значительным и отрицательным в линейном и квадратичном выражении для образцов, обработанных обоими растворами.

    Читайте также:

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *